壁虎脊髓细胞的原代培养及形态学观察
作者：顾芸，刘梅，刘炎，顾晓松
【摘要】 目的：探讨壁虎脊髓细胞分离及培养方法。方法：分离壁虎脊髓，消化接种于细胞培养瓶中, 采用不同渗透压、pH值、温度、消化、粘附基质的培养条件。结果：5％CO2、饱和湿度培养条件，在添加10％FBS的DMEM/F12培养基（渗透压200～260mmol/kg，pH7.2）中，获得了不同细胞类型的细胞，其中包括神经元样和胶质细胞样细胞，神经元样细胞NF染色阳性，GFAP染色阴性，而胶质样细胞GFAP染色阳性。结论：建立了壁虎脊髓细胞分离及培养方法，为壁虎脊髓再生过程中基因的研究提供细胞水平功能平台。
【关键词】 细胞原代培养；传代培养；脊髓损伤；壁虎
脊髓损伤是目前神经和其他相关学科研究的热点之一。传统观念认为，成体中枢神经系统损伤不能再生，脊髓损伤后由于局部缺乏合适的微环境，损伤的神经元无法再生、修复。低等脊椎动物的脊髓有内在的再生能力[1]，但其再生的机制仍然是悬而未决的问题。爬行动物壁虎能够断尾再生，最明显的特征可能是脊髓的分化潜能[2]。因此，我们试图通过建立壁虎细胞培养的体外研究平台，从细胞学水平研究其再生机制，以期为脊髓损伤的修复提供依据。首次探讨了脊髓细胞的取材、分离及培养方法，并对细胞的形态学进行了研究，为后续的脊髓再生机制和基因功能研究打下基础。
1 材料和方法
1．1 动物来源 实验用动物捕获自野生环境，经鉴定为多疣壁虎（Gekko japonicus）。选择成年正常壁虎4只，体重3.0±0.5g，全长约10cm，无断尾或其他损伤，雌雄不限。
1．2 主要试剂 DMEM/F12培养基、胰酶、多聚左旋赖氨酸(Gibco)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料研究所)；兔抗GFAP多克隆抗体（DakoCytomation 公司)；兔抗NF200多克隆抗体、FITC标记羊抗兔二抗、TRITC标记羊抗兔二抗、Hoechst 33342（Sigma 公司）；其他试剂为国产分析纯。
1．3 方法
1．3．1 培养基组成 DMEM/F12培养基，调渗透压为200～260mmol/kg，pH 7.2。添加10％胎牛血清，1％双抗（青霉素和链霉素各100 IU／L）和1％谷氨酰胺。
1．3．2 原代细胞培养 成年多疣壁虎4只，冰上麻醉，常规碘伏消毒皮肤后，去背部皮肤、肌肉后，用显微持针器将椎骨完全打开，将脊髓完整取下，立即置于预冷的DMEM抗生素液中(青霉素和链霉素各100IU／L)，在解剖镜下将膜剥去，按下面的方法准备培养。
用含有抗生素的DMEM液将脊髓充分清洗3遍，用眼科剪剪碎，加入0.25％胰酶，在30℃孵育箱中孵育l5～20 min；完全培养液终止消化，制成细胞悬液。1000rpm/min离心10min后去除上清液，加完全培养液4.0～4.5 ml，重悬细胞，调整细胞密度为1×105，种植于已用多聚赖氨酸包被的25cm2的细胞培养瓶内，于30°C，5％ CO2，饱和湿度条件下培养，每天观察细胞形态。
1．3．3 传代细胞培养 待细胞长成致密单层后即可进行细胞传代，弃去生长液，以0.25%胰酶消化，待消化完全后弃去胰酶，加适量新鲜生长液，反复吹打，制成单细胞悬液，然后以1∶2或1∶3传代，30℃培养，待长成致密单层时，再按上述方法传代。
1．3．4 荧光免疫细胞化学分析 培养细胞胰酶消化后，种于浓度为0.05mol/L 的多聚赖氨酸包被过的圆玻片上，培养24h后，经4% 多聚甲醛室温固定30min, 0.01mol/L PBS洗涤10min×3次、37℃条件下封闭60min后( 封闭液为含10%羊血清、0.1% Triton X-100 的0.01mol/L PBS液)，分别滴加一抗（兔抗GFAP，1∶500稀释；兔抗NF200，1∶200稀释），4℃放置过夜，0.01mol/L PBS洗涤10min×3次后，分别滴加FITC标记羊抗兔二抗（1∶1000稀释）；TRITC标记羊抗兔二抗(1∶1000稀释），以Hoechst（5μg/ml）标记细胞核，室温、避光放置1h，0.01mol/L PBS洗涤10min×3次，激光共聚焦显微镜观察免疫荧光细胞化学检测结果。
2 结果
2．1 细胞形态学观察 壁虎的脊髓细胞原代培养1周，只有少量细胞贴壁，培养瓶内可见到大量的细胞碎片，团块状絮状物及成团状或散在的细胞，该部分贴壁细胞，呈扁多角形、圆形或多边形。这些细胞胞核清楚、胞质清亮，细胞间充满黑色颗粒，被称作“窝形”细胞。
培养2至3周后，细胞开始大量贴壁生长，除可观察到较多的细胞碎片、桑椹样堆积的圆形细胞外，逐渐出现一些纺锤形细胞；这些细胞先伸出一根突起，然后再伸出第二根突起，形成双极形细胞或梭形细胞。培养4周后，可见较多成团生长的细胞，其形状基本可区分为扁平状细胞；多极形细胞；成纤维形细胞；双极形细胞；梭形细胞；纤维形细胞；星形细胞；窝形细胞八种类型(见封二图1)。其中扁平细胞胞体较大，平铺生长，增殖速度较慢；多极细胞呈团状生长，胞体呈多边形，有多个突起呈放射状排列；成纤维细胞有多个突起，胞体较大不规则，细胞增殖速度较快；梭形细胞和双极细胞的核呈扁卵圆形，位于细胞中部，细胞增殖速度快，生长具有方向性；纤维形和星形细胞成团生长，但联系松散，生长没有方向性。据报道“这些梭形、纤维形、星形和双极形细胞主要是胶质细胞，扁平细胞属上皮细胞，多极形细胞为神经元，窝形细胞可能是未分化的神经胶质细胞”。
壁虎细胞原代培养的时间较长，大约5周左右才能形成致密单层，传代时间为1周1次，细胞可以传到第8代。
2．2 荧光免疫细胞鉴定 通过间接免疫荧光的方法，在激光共聚焦显微镜下检测到多极形细胞为NF表达阳性（见封二图2），GFAP表达阴性（见封二图3），检测到纤维形细胞GFAP表达阳性（见封二图4）。
2．3 温度、渗透压和pH值的变化对细胞生长的影响 将原代的壁虎细胞分别置于温度为24℃、28℃、30℃、34℃、37℃；培养基渗透压为180、200、240、280、300、320、340、360mmol/kg，pH值为6.8、7.0、7.2、7.4的条件下培养，每天观察。结果显示，在培养温度为30℃、培养基渗透压在200～260mmol/kg间，pH7.2的条件下，壁虎细胞易贴壁，且生长状态较好。
3 讨论
脊髓作为中枢神经的一部分，不但是支配肢体运动、感觉、内脏活动的低级中枢，而且是联系高级神经中枢即大脑和外周神经系统的关键结构。脊髓损伤造成的灰质和白质受损，神经通路中断和继发性脊髓损伤，最终导致脊髓细胞死亡，退变，上、下行纤维传导中断，导致永久性的偏瘫或四肢瘫痪以及瘫痪部位感觉功能丧失[3]。
爬行动物相对于哺乳动物来说，比较低等，仍然属于变温动物。但是相对于更为低等的其它脊椎动物如两栖动物、鱼类来说，它又是真正的陆生动物，完全脱离了水对它的限制。因此，我们在进行壁虎细胞培养的时候，必须考虑爬行动物的特殊生活环境，特别是温度和渗透压。本文国内有关资料[4~7]首次探索了成体壁虎脊髓细胞的原代和传代培养，并对其部分细胞进行了鉴定。结果表明自壁虎脊髓中可以成功培养出8种形态的细胞。荧光免疫细胞化学表明，这些细胞中的多极形细胞可能是神经元，纤维形细胞可能是胶质细胞。
在鉴定各种形态的壁虎细胞的过程中，由于亲缘性的关系，很多标志蛋白抗体缺乏，给我们确定细胞种类带来了很大的困难，因此有很多细胞是同属一种细胞的不同形态还是属于不同类型的细胞，尚有待进一步的阐明。另外，虽然自壁虎脊髓中成功培养出8种形态的细胞，为细胞自身移植修复脊髓损伤打下了细胞学基础，但脊髓组织培养后成分较多，细胞的种类和功能尚不明，因此还需进一步纯化、鉴定和研究。
我们对低等脊椎动物中枢神经再生的研究旨在发现其再生的机制与哺乳动物有何不同。通过建立细胞水平研究的体外平台，阐明信号系统，转录因子，转录效应产物的种类、结构和功能等，可能为高等哺乳动物中枢神经再生提供一些帮助。
【参考】
[1] Chernoff EA. Spinal cord regeneration: a phenomenon unique to urodeles[J]. Int J Dev Biol, 1996，40(4): 823-831.
[2] Anderson MJ, Rossetto DL, Lorenz LA. Neuronal differentiation in vitro from precursor cells of regenerating spinal cord of the adult teleost Apteronotus albifrons[J]. Cell Tissue Res, 1994，278(2): 243-248.
[3] Clarke JD, Tonge DA, Holder NH. Stage-dependent restoration of sensory dorsal columns following spinal cord transaction in anuran tadpoles[J]. Proc R Soc Lond B Biol Sci,1986,227(1246):67-82.
[4] Benraiss A, Caubit X, Arsanto JP, et al. Developmental dynamics, clonal cell cultures from adult spinal cord of the amphibian urodele pleurodeles waltl to study the identity and potentialities of cells during tail regeneration[J]. Dev Dyn, 1996, 205(2):135-149.
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[6] Koment RW, Haines H. Characterization of a reptilian epithelioid skin cell line derived from the green sea turtle, Chelonia mydas[J]. In Vitro, 1982 ,18(3 Pt 1):227-232.
[7] 薛庆善.体外培养的原理与技术[M].第1版. 北京：出版社，2001：656-659.
