松花粉对砷中毒大鼠外周血T淋巴细胞rDNA转录活性的影响

            作者：罗艳红，黄晓敏，龚厚文，韦文龙，陆兰芬，韦玉脉，韦耀东

【摘要】  目的 通过研究松花粉对砷中毒大鼠的外周血rDNA转录活性的影响来检测松花粉对砷中毒大鼠免疫功能的调节作用。方法 将54只SD大鼠随机分为3组。正常对照组饮用蒸馏水；组、中毒对照组均隔天注射NaAsO2（8mg/kg）进行砷染毒，治疗组在砷染毒进行的第15天后开始用松花粉灌胃（6.25g/kg）。至第45天，分别测各组外周血中T淋巴细胞rDNA转录活性。结果 中毒对照组与治疗组相比rDNA转录活性显著降低（P<0.01）；中毒对照组与正常对照组相比，rDNA转录活性极显著降低（P<0.01）。结论 松花粉能提高砷中毒后大鼠rDNA转录活性，即提高其免疫力。

【关键词】  松花粉；砷中毒；大鼠；动物实验；DNA；转录；T淋巴细胞

    Abstract:  Objective  To explore the immunologic regulation ability of Pine Pollen on arsenic (As) poisoning rat by mearsuring the rDNA transcription activity of peripheral blood lymphocyte.  Methods  54 experimental rats were randomly divided into three groups: Group A (the normal group), Group B (the treated group) and Group C (the poisoned group). From beginning, the normal group was administrated with distilled water while the poisoned group and the treated group were injected with NaAsO2 8mg/kg every other day. 15 days later, the treated group was intragastrically administrated with Pine Pollen 6.25g/kg. Up to 45 days, the rDNA transcription activity of peripheral blood lymphocyte of the 3 groups were tested.  Results  The rDNA transcription activity of Group C decreased apparently and significantly (P<0.01) compared with Group B and Group A, respectively.  Conclusion  Pine Pollen can elevate rDNA transcription activity of arsenic poisoning rats, i.e., up-regulate their immunity. 

    Key words:  Pine Pollen; arsenic poisoning; rats; animal experiment; DNA; transcription; T-lymphocytes

    现已知道，T淋巴细胞在机体抗肿瘤免疫应答过程中，处于关键地位。肿瘤的形成一方面是由于机体免疫功能下降或瘤细胞的发生超出免疫监视和免疫清除；另一方面，肿瘤血清中出现的抑制性细胞因子使T淋巴细胞核中和核糖核蛋白体脱氧核糖核酸rDNA的转录活性下降，进而抑制了机体的免疫功能［1］。由于肿瘤机体的免疫功能状态随着肿瘤的不断生长而进行性下降，其各种特异性和非特异性的细胞免疫与体液免疫均受到显著的抑制。而我们知道砷中毒可以导致肿瘤发生，因此，对砷中毒大鼠免疫功能状态的准确评估有重要意义。rDNA转录活性可评估机体的免疫状态［2］，另外，它也可以作为判断细胞耐药指标之一［3］。松花粉的排砷、保护机体方面的作用已有研究［4］，笔者现通过测定外周血rDNA转录活性的高低来评判其能否提高砷中毒大鼠的免疫力。

    本次研究采用CIAS-1000型细胞图像分析系统，从基因转录水平上定量分析砷中毒大鼠以及松花粉治疗组外周血T淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白（Argyrophilic nucleolar organizer region proteins,Ag-NORs），以银染面积与细胞核面积比（I.S%）作为Ag-NORs检测指标，反映T淋巴细胞核内rDNA的转录活性，对免疫功能状态进行分析，为砷中毒大鼠的预后评估提供的依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  试剂 

　　NaAsO2，分析纯，购自上海试剂总厂第四分厂；T淋巴细胞rDNA转录活性分析试剂购自广州康立得医疗科技有限公司。

　　1.2  药品 

　　国珍松花粉购自新时代公司。

　　1.3  动物分组 

　　雌性SD大鼠54只（购于广西医科大学实验动物部），均为12周龄，体重160g左右，普通（清洁）级。将大鼠分为3组，每组18只。

　　1.4  染毒和 

　　正常对照组，自行饮用蒸馏水；治疗组，中毒对照组为中毒组，用亚砷酸钠染毒，8mg/kg体重隔天腹腔注射。15天后，治疗组的大鼠用国珍松花粉（6.25g/kg 体重）持续灌胃治疗，至第45天处理各组动物。

　　1.5  采样和检测方法及仪器 

　　剪颈动脉，取血0.5ml，肝素抗凝，加入4 ml培养液含有PHA的密闭培养瓶中，置37℃培养箱72h，每24h摇匀1次。将培养的细胞悬液离心收集细胞。经低渗溶液破坏红细胞，固定液固定细胞后，80℃～90℃下银染。每组至少做3个片子，具体操作方法见T淋巴细胞快速染色试剂盒说明书。上CIAS-1000型细胞图像分析系统（广州康立得医疗科技有限公司生产），于40倍显微镜下采集图像，每片10个T淋巴细胞核仁银染面积与细胞核仁面积比值（I.S%）。

　　1.6  统计方法 

　　采用方差分析及t检验进行统计学处理。

　　2  结果

    T淋巴细胞I.S%测定结果，中毒对照组最低，治疗组最高，见表1。表1  3组大鼠T淋巴细胞I.S%的测定  (略)

　　3  讨论

    砷中毒后可引起机体肿瘤免疫力降低。笔者在砷中毒大鼠模型中也发现肝部有疑似肿瘤病变。一旦肿瘤发生，肿瘤可以释放免疫抑制因子以进一步降低机体免疫力，以致免疫功能的损伤不断积累。由于肿瘤机体外周血T淋巴细胞Ag-NORs转录活性受到特异抑制，且外周血T淋巴细胞方便易得，故其在肿瘤免疫诊断中具有重要意义。外周血中有核细胞主要是粒细胞与淋巴细胞，经PHA刺激培养，淋巴细胞转化生长而粒细胞不转化，因此，经Ag-NORs显色后，圆而大的核内棕黄色颗粒的大小强度主要反映淋巴细胞的rDNA转录活性。经流式细胞分析仪分析显示，外周血培养后B淋巴细胞所占比例相对较少，而T淋巴细胞占了绝大部分，因此，转化生长的淋巴细胞主要为T淋巴细胞，所作Ag-NORs染色可以反映T淋巴细胞的rDNA转录活性。利用图像分析系统检测T淋巴细胞的I.S%值可以反映rDNA转录活性［5,6］。
     
　　本次实验结果证明，松花粉能提高砷中毒大鼠的I.S%值，即提高T淋巴细胞的rDNA转录活性，也就是提高机体免疫力。这可能是它能刺激造血细胞从而促进rDNA或rRNA的合成代谢有关。本实验结果可为临床上砷中毒的辅助治疗提供。

【参考】
  　　［1］姜又红，隋承光，孟凡东，等.外周血T淋巴细胞Ag-NORs检测在肿瘤监测中的意义［J］.癌变·畸变·突变，2004，16（4）：247-256.

　　［2］刘广贤，孔宪涛，张婧，等.T淋巴细胞核仁区酸性非组蛋白在肿瘤诊断与监测中的价值［J］.中华检验医学杂志，2001，24（3）：151-153.

　　［3］杜可，田道法.核仁组成区相关嗜银蛋白表达及中药干预［J］.湖南中医学院学报，2004，24（2）：62-64.

　　［4］罗艳红，黄晓敏，韦文龙，等.松花粉对砷中毒大鼠的防护作用［J］右江民族医学院学报，2007，29（1）：24-25.

　　［5］刘涛.外周血T淋巴细胞Ag-NORs检测及其运用［J］.国外医学：临床生物化学与检验学分册，2003，24（2）：120-121.

　　［6］许良中，周晓燕，朱伟萍，等.外周血淋巴细胞亚群检测及其rDNA转录活性分析［J］.癌症杂志，1999，9（4）：265-268.