慢性重型乙型肝炎外周血单核细胞上mCD14的表达及意义

【摘要】  目的 观察慢性重型乙型肝炎患者外周血单核细胞上膜型CD14(mCD14)表达情况，并探讨其意义。方法 采用流式细胞术法检测30例慢性重型乙肝患者、20例慢性乙肝患者和10例正常人外周血单核细胞上 mCD14水平，应用动态浊度法检测血浆内毒素水平。结果 慢性重型乙肝组患者血浆内毒素水平（0.523±0.453）均高于慢性乙肝组（0.0431±0.0327 ）和健康对照组（0.0215 ±0.0158），P均<0.05，但慢性重型乙肝组患者外周血单核细胞mCD14表达水平与慢性乙肝组、对照组相比较差异无显著性（P均>0.05）。结论 慢性重型乙肝血浆内毒素水平普遍升高，但外周血单核细胞上mCD14水平并未上调，推测可能与mCD14大量脱落进入血清转变成可溶性CD14(sCD14)有关。

【关键词】  肝炎，乙型，慢性；单核细胞；CD14

    慢性重型乙型肝炎患者由于肝细胞功能严重受损，来自肠道的革兰阴性杆菌内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)易进入体循环，而产生肠源性内毒素（Intestinal endotoxemia，IETM）。IETM对肝脏的影响，并不在于内毒素的直接作用，而是内毒素诱导单核巨噬细胞产生过多的炎症介质导致肝细胞炎症坏死［1］。CD14作为革兰阴性细菌脂多糖的高亲和性受体在此起到至关重要的作用，因此，为了探讨肝炎重型化过程中IETM激活单核巨噬细胞系统诱导失控性炎症反应的机理，我们应用流式细胞技术对30例慢性重型乙肝患者和20例慢性乙肝患者外周血单核细胞上mCD14水平进行研究。

　　1  资料与方法

　　1.1  病例选择
 
　　全部病例均为我院感染科2005年6月～2006年10月门诊及住院患者。其中慢性重型乙型肝炎组（早期）30例，男20例，女10例，年龄32.61±7.25岁;慢性乙型肝炎组（轻度）20例，男14例，女6例，年龄 31.7±8.32岁。诊断符合2000年《病毒性肝炎防治方案》所定的标准［2］。所有病例均未合并感染或其它慢性疾病。10例门诊体检者为正常对照组，男6例，女4例，年龄29.8±6.58岁。

　　1.2  标本采集 

　　无菌条件下一次采集研究对象静脉血4ml，分别置于2支试管中：一支无热原处理的肝素抗凝管（2ml）、离心取上清液放入-30℃冰箱内保存；另一支2%EDTA抗凝管(8 ml)，常规采用Ficoll-Hypaque密度梯度法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。调整细胞浓度1×106/ml。

　　1.3  流式细胞术分析 

　　采用荧光素单抗体标记结合流式细胞仪检测，取流式细胞专用试管2支，分别加入IgG（阴性对照），CD14单克隆抗体各5μl和外周血单个核细胞100μl，混匀置室温20℃避光孵育30min，然后用PBS 2ml洗涤，1200r/min离心3min，洗去未结合单抗，加入PBS 0.5ml上机检测。采用BD公司的CellQuest软件进行测定分析，每次获取10000个细胞以“门技术”确定单核细胞群并统计结果。

　　1.4  内毒素测定
 
　　采用天津大学无线电厂生产的BET-32B型细菌内毒素测定仪检测，原理是动态浊度法。自动吸光度达到设定值的临界反应时间，根据临界反应时间的对数LgT与内毒素含量的对数LgC负相关，用系列梯度稀释的内毒素标准品溶液检测反应时间，制成标准曲线，使用标准曲线法进行定量检测未知样品。（细菌内毒素工作标准品批号：2005-6，药品生物制品检定所。鲎试剂批号：20050728，湛江海洋生物制品厂）

　　1.5  统计学处理 

　　计量数据以±s表示，各组间差异显著性分析方法采用SPSS统计软件中单因素方差分析。

　　2  结果

　　2.1  慢性重型乙肝组与慢性乙肝组、对照组内毒素水平的比较 

　　慢性重型乙肝组患者内毒素水平与慢性乙肝组、健康对照组相比较差异有显著性（P<0.05），提示慢性重型乙肝患者血浆内毒素水平普遍升高，见表1。表1  慢性重型乙肝组与慢性乙肝组、对照组
内毒素水平比较  (略)

　　2.2  慢性重型乙肝组与慢性乙肝组、对照组外周血单核细胞mCD14表达水平比较 

　　慢性重型乙肝组患者外周血单核细胞mCD14表达水平与慢性乙肝组、健康对照组相比较差异无显著性（P均>0.05），慢性乙肝组与健康对照组患者外周血单核细胞mCD14表达水平差异亦无显著性（P>0.05），见表2。表2  慢性重型乙肝组与慢性乙肝组、对照组外周血单核细胞mCD14表达水平比较  (略)

　　3  讨论

    近年来， IETM与肝炎的关系日益受到重视。一般认为IETM与肝损害互为因果关系，并对肝炎重型化的发生与起到关键性作用。动物实验证实各种实验性肝病多伴有IETM。临床观察也表明，尽管对各种急、慢性肝炎、肝硬变、重症肝炎等患者的IETM发生率报道不一，但普遍认为肝病时存在程度不等的IETM，尤以重型肝炎更明显［3,4］。目前大多数采用基质显色法检测血浆内毒素水平，本实验是采用动态比浊法检测，但所得比较结果与基本相符，慢性乙肝组患者内毒素水平很少超过0.1EU/ml，而慢性重型乙肝组患者内毒素水平平均值达到0.523 EU/ml。这提示IETM与肝炎重型化有密不可分的关系。
   
　　目前关于IETM在肝炎重症化中的作用机理在体内研究甚少，所获的资料多来自外源性内毒素注射给动物或体外细胞培养所作的观察。因此研究人体内单核巨噬细胞表面上LPS相关受体的表达以及其后的胞内信号传导途径，对阐明肝炎重型化过程中肠源性内毒素激活单核巨噬细胞系统诱导失控性炎症反应的机理意义重大。

    1990年，Wright等［5］首次发现CD14作为LPS受体，在LPS结合蛋白(LPS-binding protein.LBP)的催化转运作用下，介导LPS性细胞反应。CD14以两种形式存在，即膜型CD14(membrance CD14, mCD14)和可溶性CD14(soluble CD14, sCD14)。mCD14主要位于成熟单核巨噬细胞表面，后者是内毒素的主要效应细胞。而sCD14则存在于血清中，由mCD14脱落或细胞分泌产生，主要介导内皮细胞、上皮细胞等CD14阴性细胞对内毒素的应答反应。CD14表达调节主要来自于LPS和LPS诱导细胞分泌的细胞因子。目前多采用体外实验观察，一般认为LPS 对CD14的表达调节是在转录水平上进行，且具有时间和剂量的依赖性。国内冯骏明等［6］人在观察LPS对大鼠库普弗细胞(KC) CD14表达影响，使用不同浓度LPS(1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml)刺激培养KC，亦发现LPS浓度增加，KC表面上CD14mRNA表达随之增加，两者有一定的剂量的依赖关系。本临床研究结果表明：慢性重型乙肝血浆内毒素水平普遍升高，但外周血单核细胞上mCD14水平却并未上调，推测可能与mCD14大量脱落进入血清转变成sCD14有关，郑瑞丹等［7］观察乙型肝炎患者血清中sCD14的水平显著高于健康人群，亦证实了上述推测。目前尚不清楚mCD14与sCD14两者在功能上关系如何。

【文献】
  　　［1］Han DW. Intestinal endotoxemia as a pathogenetic mechanism in liver failure ［J］. World J Gastroenterol，2002,8(6):961-965.

　　［2］中华医学会传染病与寄生虫病学分会.病毒性肝炎防治方案(试行)［J］.中华传染病杂志，2000，8（6）：324.

　　［3］Sozinov AS. Systemic endotoxemia during chronic viral hepatitis ［J］. Bull Exp Biol Med,2002,133(2):153-155.

　　［4］Qin B, Qie CH, Zhang DZ, et al. The effect of artificial support system on serum cytokine in chronic severe hepatitis ［J］. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi,2004,12(5):293-295.

　　［5］Wright SD, Ramos RA, Tobias PS, et al. CD14, a receptor for complex of lipopolysaccharide and LPS binding protein ［J］. Science,1990,249:1431-1433.

　　［6］冯俊明，刘友生，史景泉，等.CD14的表达及其在库普弗细胞激活中的意义［J］.中华烧伤杂志,2002,18(2):107-110.

　　［7］郑瑞丹,饶日春.慢性乙型肝炎患者血清sCD14的水平与肠源性内毒素血症的关系［J］.第一军医大学学报,2000,20(5):406-407.