多聚酶链反应检测老年人肺炎支原体的研究

【摘要】  目的 探讨肺炎支原体（MP）与老年呼吸道感染的关系。方法 应用多聚酶链反应（PCR）检测128例急性期老年患者痰和分泌物MP-DNA，其相应血清进行MP-IgM检测。结果 128例急性期患者MP-DNA中有81例表达阳性，阳性率为63.28％（81/128），而血清学试验检测阳性率为28.13％（36/128），两者均阳性32例，两者均阴性58例，MP-DNA阳性而MP-IgM 阴性38例，PCR法和血清学试验两者阳性符合率为39.51％。结论 应用PCR方法检测急性期老年患者 MP-DNA 较血清学法更敏感，阳性率高。

【关键词】  多聚酶链反应；支原体，肺炎；老年人

    肺炎支原体(mycop lasma pneumoniae，MP)是引起原发性非典型肺炎及其他呼吸道感染性疾病的常见病原微生物［1］。近年来，MP已成为老年人常见病原菌之一［2］，为了探讨老年呼吸道感染与MP的关系，我们应用多聚酶链反应（PCR）技术检测了老年患者急性期临床中的MP特异性DNA片段，阳性率达63.28％，现报告如下：

　　1  资料与方法

　　1.1  一般资料 

　　128例老年肺炎患者选自2005年1月～2006年12月我院住院及门诊病人。病房及门诊病人均经临床及胸片X线检查诊断为肺炎，其中男81例，女47例，中位年龄69岁。

　　1.2  标本采集 

　　患者发病两天内采集标本，用5ml玻璃管取受检患者肺深部咳出的痰液1～3ml密封送检，咽拭子则用棉拭子取咽部分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管中密封送检，采集的标本均保存于-20℃待测。另采集2.0ml静脉血进行MP特异性IgM抗体检测。

　　1.3  检验方法

　　1.3.1  标本处理 

　　痰液中加入4倍体积的生理盐水，轻轻振荡后置4℃冰箱过夜，然后取1.0ml于1.5ml离心管中，12000r/min离心5min去上清，沉淀加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃ 10min后，12000r/min离心5min备用；咽拭子的玻璃管中则加入1.0ml的生理盐水，充分振荡后挤干棉拭子，将全部液体转入1.5ml离心管中，12000r/min离心5min，后续处理同痰液。

　　1.3.2  PCR 

　　按［3］合成MP PCR引物，上游: 5′-AA GCTTA TTGGTACA GGTT-3′，下游: 5′-TTACCA TCCTTGTTGTTA -3′；PCR反应体系25μl，含0.2μM引物，2.0mM MgCl2、0.2 mM dNTPs和1U Taq酶（MBI公司），反应条件为94℃ 30s、55℃ 30s、72℃1min，共40个循环。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果，阳性条带为150bp。

　　1.3.3  MP特异性IgM抗体检测 

　　用间接血凝法检测MP特异性IgM抗体，双份血清MP抗体滴度4倍及以上判断为阳性，或血清抗体效价≥1∶32判断为阳性。

　　2  结果
       
　　经PCR检测发现128例急性期患者MP-DNA中有81例表达阳性，阳性率为63.28％（81/128），而血清学试验检测同一患者血清MP-IgM，阳性率为28.13％（36/128），两者均阳性32例，两者均阴性58例，MP-DNA阳性而MP-IgM阴性38例，PCR法和血清学试验两者阳性符合率为39.51％。

　　3  讨论

    MP是介于细菌和病毒之间的一种无细胞壁的微生物，主要通过飞沫感染呼吸道，其发病机理由于MP可通过血行进行播散直接侵犯全身各器官组织，以及MP抗原与人体多种组织存在部分共同抗原引发免疫损伤而致多器官损害，近年来，MP已成为老年人常见病原菌之一［4］。随着我国人口老龄化，老年人MP肺炎越来越受到临床的关注，但由于MP感染后机体在1周后才能产生IgM 抗体，因此用血清法检测早期患者血清MP-IgM阳性率较低，不利于PM感染患者得到及时诊治。此外，大约20 %成人再次感染MP后几乎检测不到特异性IgM 抗体［5］。

    国内曹倩等［6］检测患儿鼻咽部分泌物MP发现，MP-DNA 均在病程第1周内检出，而MP-IgM抗体73.68%在发病1～2周内检出，仅有26.42 %在病程1周内呈阳性。提示，对于病程1周内的患儿，快速、特异、敏感的PCR方法是检测MP的最佳选择，而间接血凝法虽敏感性稍差，这与我们检测老年患者的MP结论相似，而老年肺炎感染后产生抗体易受宿主状态的影响，当机体免疫功能低下时，难以产生抗体或抗体滴度较低或抗体产生缓慢，不易检出MP-IgM，再者血清学方法本身存在的非特异性及敏感性差，这在一定程度上也影响了MP抗体的检出率。

    刘春灵等［7］则提出，单次血清MP抗体滴度升高可能是6天～3年间的1次MP感染产生的，血清特异性MP-IgM抗体检测、PCR检测MP-DNA等实验室诊断方法都不能作为MP的现时感染的确诊手段。但我们用PCR方法直接从患者标本中检测MP，效果较好，发病初期PCR法检出率明显高于血清学方法，因此我们认为PCR法是目前MP感染老年人患者较为直观的检测方法，因为：①PCR可直接从临床标本中检测MP-DNA，具有快速、特异、敏感，而血清学方法为间接的、回顾性的；②PCR法不受机体免疫状态的影响而血清学方法在机体免疫状态低下，如严重的基础疾病、肿瘤、免疫抑制剂时，抗体滴度极低，不易检出；③PCR法对临床诊断、、疗程及疗效判断有直接的指导意义，血清学除作回顾性诊断外，对临床治疗的指导意义不大。

    综上所述，对患有急性呼吸道感染的老年患者，建议用 PCR 法常规检测MP-DNA，但应做好质量控制防止假阳性污染，而对于发病数周后的患者可结合血清学检测用于回顾性诊断。

【】
  　　［1］孙红妹.肺炎支原体感染的实验室诊断［J］.实用儿科临床杂志，2007，22(4):245-248.

　　［2］岳猛，姜绯.老年人肺炎支原体感染调查分析［J］.医科大学学报，2006，35(5):553.

　　［3］尤兰华，周荣菊，封锦芳.发热及不发热急性呼吸道感染患者肺炎支原体肺炎衣原体的检测［J］.中国误诊学杂志，2007，7(7):1476.

　　［4］宫向荣，杜涛.肺炎支原体感染后老年人白细胞变化的探讨［J］.实用医技杂志，2007，14(8):981-982.

　　［5］方德刚，肖清华.支原体感染免疫研究进展［J］.医学临床研究，2006，23(8):1276-1277.

　　［6］曹倩，阎世坤，王琳琳，等.聚合酶链式反应技术和间接血凝试验检测肺炎支原体的应用比较［J］.医学检验与临床，2007，8(2):76.

　　［7］刘春灵，纪树国，张波，等.成人肺炎支原体现时感染患者的临床分析［J］.中华医学杂志，2005，86（17）：1187-1190.