四种纯化弓形虫速殖子方法对虫体RNA影响的比较

             作者：杨秋林，许丽芳，伍和平

【摘要】  目的 比较纯化弓形虫速殖子的四种方法对虫体RNA的影响。方法 以2.0×105个速殖子腹腔接种于昆明小鼠，72h后收集小鼠腹腔液，以胰蛋白酶消化法、微孔滤膜过滤法、G3滤斗和CF-11纤维素柱法纯化弓形虫速殖子，用AGPC法抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳检测总RNA。结果 胰蛋白酶消化法虫体回收率最大，但时间长，易造成RNA降解；微孔滤膜过滤法回收率低；G3滤斗纯度不高；CF-11纤维素柱法快速简单、纯度高，对RNA无影响。结论 微孔滤膜过滤法、CF-11纤维素柱法对虫体RNA的影响小，较适用于cDNA文库构建时虫体的分离纯化。

【关键词】  弓形虫，病；胰蛋白酶消化法；微孔滤膜过滤法；G3滤斗；CF-11纤维素柱法

　　为构建高质量的cDNA文库及在其它的一些研究中，必须在尽可能短的时间里从感染弓形虫的小鼠腹水中去除炎性细胞、腹腔细胞和红细胞，纯化弓形虫速殖子，以减少mRNA的降解。为此我们比较了四种不同的纯化方法对虫体RNA的影响，以期尽可能快地获得较纯的弓形虫速殖子，提取高质量的mRNA。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  弓形虫虫株  弓形虫昆山分离株由江苏省寄生虫病研究所王崇功教授赠送。

　　1.1.2  试剂  胰蛋白酶购自华美公司，微孔滤膜（直径3μm）、G3滤斗购自上海医药研究院。CF-11纤维素购自Whatman公司；其余试剂为国产分析纯。

　　1.2  方法

　　1.2.1  虫体的收集  以2.0×105个速殖子腹腔接种于昆明小鼠，72h后收集小鼠腹水，3000r/min离心8min，弃上清。

　　1.2.2  胰蛋白酶消化法  虫体中加入20倍量压积的0.25%～0.3%胰蛋白酶消化液，37℃消化30 min，PBS洗两次，沉淀如上法重复消化洗涤一次。镜检记数。

　　1.2.3  微孔滤膜过滤法  虫体中加适量PBS制备虫体悬液，过内装直径3μm 微孔滤膜的滤器，收集滤出液，离心。镜检记数。

　　1.2.4  G3滤斗  虫体悬液过G3滤斗，收集滤出液，离心，镜检。

　　1.2.5  CF-11纤维素  CF-11纤维素在PBS中4℃过夜，弃浮在上面的细颗粒，装柱约3cm高。加虫体悬液10ml，20ml PBS洗柱，收集滤出液，离心，镜检记数。

　　1.2.6  弓形虫速殖子总RNA的抽提  分别以AGPC法抽提以上四种方法纯化的虫体总RNA［1］，75%乙醇洗涤总RNA沉淀三次后空气干燥10min，最后将总RNA沉淀溶于DEPC处理过的ddH2O中，用甲醛变性胶电泳检测总RNA［2］。

　　2  结果

　　2.1  四种方法的虫体回收率、白细胞清除率、红细胞清除率及所需时间  胰蛋白酶消化法虫体回收率最大，但时间长，易造成RNA降解；微孔滤膜过滤法回收率低；G3滤斗纯度不高；CF-11纤维素柱法快速简单、纯度高，对RNA无影响。见表1。

　　表1  四种纯化方法的比（略）

　　2.2  甲醛变性胶电泳检测总RNA结果

　　A  胰蛋白   酶消化法          B  CF-11   纤维素          C  1.微孔滤膜过   滤法；2.G3滤斗

　　图1  用甲醛变性胶电泳鉴定弓形虫总RNA（略）

　　可见从用胰蛋白酶消化法（见图A）纯化的虫体中抽提的总 RNA在甲醛变性胶上呈弥漫一片，分子量偏小，说明RNA有降解。从用CF-11纤维素（见图B）、微孔滤膜过滤法（见图C1）和G3滤斗（见图C2）纯化的虫体抽提的总RNA在甲醛变性胶上可见28srRNA和18srRNA两条带，28srRNA的条带明显比18srRNA带亮，说明RNA没有降解。

　　3  讨论  

　　提纯弓形虫的方法较多，各有优缺点［3］。胰蛋白酶消化法能破坏细胞，使胞内虫体释出，虫体回收率达140%，白细胞的清除率也高，可用于大量制备抗原。但所需时间长，工作量大，对mRNA的质量有影响，不适于cDNA文库的构建。微孔滤膜过滤法虽然能使虫体纯度最高，但回收率太低，且存在滤膜易破、分离量少等缺点，可能与膜的质量有关。G3滤斗法快速，但虫体的纯度不够，也可能与我们所购G3滤斗的孔径标准有关。CF-11纤维素法具有快速简单、纯度高等优点，虽然红细胞清除率低，但红细胞没有细胞核，对弓形虫mRNA的抽提影响不大。所以该法较适用于cDNA文库构建时虫体的分离纯化［4］。

【】
  　　［1］ Piotr Chomczynski and Nicoletta Sacchi.Single-Step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-penol-chloroform extraction ［J］.Analytical Biochemistry 1987，162: 156-159.

　　［2］ Lehrach H，D.Diamond JM，Wozney.RNA molecular weight determinations by gel electrophoresis under denaturing conditions，a critical reexamination ［J］.Biochemistry，1977，16: 4743.

　　［3］ Robert P，Dempster.Toxoplasma gondii:purification of Zoites from peritoneal exudates by eight methods ［J］.Experimental parasitology，1984，57: 195-207.

　　［4］ 杨秋林，陆惠民，邬敏辰，等.弓形虫昆山分离株速殖子期表达型cDNA的构建及鉴定［J］.人兽共患病杂志，2000，（10）：25-27.