白英提取液对Hela细胞凋亡及P53和Bcl-2蛋白表达的影响
作者：韦星，李朝敢，农嵩，黄晓敏，王世疆
【摘要】 目的 探讨白英提取液对Hela细胞凋亡及野生型P53(wtP53)和Bcl-2蛋白表达的影响。方法 采用MTT法检测细胞增殖抑制率，荧光显微镜检测癌细胞形态变化，TUNEL法检测凋亡率，二步法免疫组化检测P53和Bcl-2蛋白表达变化。结果 白英提取液能够抑制Hela细胞增殖，且呈剂量依赖性；观察到凋亡细胞典型的形态特征；细胞凋亡率随白英提取液浓度增加而升高；P53蛋白表达显著上升（P<0.01），而Bcl-2蛋白表达明显下降（P<0.01）。结论 白英提取液能促进Hela细胞凋亡，其分子机制可能与上调野生型P53蛋白表达和下调Bcl-2蛋白表达有关。
【关键词】 白英提取液；宫颈肿瘤；Hela细胞；细胞凋亡；蛋白质P53；Bcl-2蛋白；基因表达
Effects of Solanum lyratum Thunb extract on induction of apoptosis and the expression of P53 and Bcl-2 protein in Hela cells
Abstract: Objective To outline the effects of Solanum lyratum Thunb (ST) extract on induction of apoptosis and the expression of wild type P53 and Bcl-2 protein in Hela cells. Methods A MTT assay was used to detect the cells proliferation inhibitory rate.Morphological changes of apoptosis were observed with fluorescence microscope.Induction of cell apoptotic rate was determined by TUNEL method.The expression of P53 and Bcl-2 proteins were detected by two-step immunohistochemical staining. Results ST extract could inhibit the proliferation of Hela cells and the inhibitory effect was dose-dependent.Typical morphology changes was found in apoptotic cells.The rate of apoptosis increased significantly with the increased concentration of the drug.The expression of P53 protein elevated significantly (P<0.01)，while Bcl-2 protein decreased markedly (P<0.01). Conclusion ST can induce the apoptosis of Hela cells，and its molecular mechanism may be associated with the up-regulating expression of wild type P53 protein and down-regulating expression of Bcl-2 protein.
Key words: Solanum lyratum Thunb extract；cervix neoplasms；Hela cells；apoptosis；protein P53；Bcl-2 protein；gene expression
近年，关于中药抗癌机理的实验研究方兴未艾，有学者报道［1］，一些中药复方或单味药的有效成分能诱导肿瘤细胞凋亡，中药抗癌疗效与中药诱导肿瘤细胞凋亡有关。白英（Solanum lyratum Thunb，ST）为茄科植物，又称白毛藤，临床常用于鼻咽癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、食管癌、胃癌等多种癌症［2］。研究发现［3］，ST脂溶性提取物具有诱导人肝肿瘤细胞BEL-7404产生凋亡作用。迄今为止，ST的抗肿瘤作用机理及其活性成分尚未完全明确。本实验观察ST水提取液诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡和抑制细胞增殖效应，以及其对野生型P53和Bcl-2蛋白表达的影响，以初步揭示ST抗宫颈癌作用机理。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 人宫颈癌Hela细胞株由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供。
1.1.2 主要试剂与仪器 胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品，四甲基偶氮唑蓝（MTT）为上海普飞生物技术有限公司产品，Hoechst 33342为Sigma公司产品，顺铂（DDP）为锦州九泰药业有限责任公司产品，鼠抗人P53(sc-126)和Bcl-2(sc-7382)单克隆抗体为Santa cruz公司产品，PowerVisionTM免疫组化检测试剂盒(PV-6001/6002)和原位细胞凋亡检测试剂盒(in situ cell death detection kit，POD)为北京中杉金桥生物技术公司产品，KHB K3型酶标仪(芬兰)，倒置显微镜(Cioc)，荧光显微镜(Nikon，Japan)，BX51型显微镜（OLYMPUS）。
1.2 方法
1.2.1 ST水提取液的制备 取ST (购于广西百色市中中药房)干品50g，用500ml水浸泡1h，加热煮沸后小火煎熬60min，室温冷却，120目网筛过滤，弃药渣，滤液离心(3，000r/min×20min×2次)。取上清液，浓缩至50ml，调pH值为7.0～7.2，0.22μm过滤除菌，获生药含量为1.0g/ml ST水提液，-20℃保存备用，实验时将含10%胎牛血清RPMI 1640培养液稀释至所需的药物浓度。
1.2.2 细胞培养和药物处理 Hela细胞培养和药物处理：以含100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10% FBS的RPMI 1640培养液，在37℃、5% CO2的培养箱中培养，细胞生长至对数增殖期，更换含12.5、25、50ml/L ST新鲜培养液。正常对照组不加药物处理，以DDP(25mg/L)为阳性对照组，药物作用时间均为48h。
1.2.3 细胞增殖抑制试验(MTT法) 将对数生长期的Hela细胞移入96孔培养板中，细胞密度约为1×104个/ml，每孔加入200μl细胞悬液，培养24h。吸弃孔内原培养液，加入含ST的10%胎牛血清RPMI 1640培养液200μl，每个药物浓度设4个平行复孔，另设DDP为阳性对照组和空白对照孔。培养到44h，每孔加入MTT（5mg/ml）20μl，继续培养4h后终止，小心吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 150μl，用震荡混合仪震荡10min，使结晶充分溶解。选择492nm波长酶标仪测定每孔光吸收值（OD值）。实验重复3次。按下公式抑制率：抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。
1.2.4 细胞Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡 用12孔培养板培养细胞，预先将小盖玻片放置于培养板底部，制作细胞爬片；药物处理细胞48h后，将Hoechst 33342加入培养的细胞中，终浓度为10μg/ml，室温染色30min；4%的多聚甲醛和培养孔内培养液按1∶3的比例混合，使多聚甲醛的浓度为1%，固定细胞10min；取出小盖玻片，风干后甘油封片，荧光显微镜观察并拍照。
1.2.5 TUNEL法检测细胞凋亡 细胞凋亡检测步骤按原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。药物作用48h后，收集各组细胞，用PBS漂洗两遍后进行细胞涂片，风干后丙酮固定15min；细胞在渗透液(0.2%Triton X-100，0.1%柠檬酸钠)中孵育5min，双蒸水冲洗玻片；滴加TUNEL反应混合物，37℃湿盒中孵育30min；滴加转化剂-POD，37℃湿盒中孵育30min，冲洗玻片；滴加DAB底物溶液，室温5～10min；蒸馏水冲洗，苏木素复染、脱水、封片；以不加TUNEL反应混合液作为阴性对照片。细胞核呈棕黄色为TUNEL反应阳性细胞(即凋亡细胞)。光镜下分析结果，随机计数10个高倍视野下阳性细胞所占百分数即为细胞凋亡率。
1.2.6 免疫组化法检测P53和Bcl-2蛋白表达变化 按照二步法免疫组化检测试剂盒说明书操作：药物处理细胞48h后，收集各组细胞，PBS冲洗2次，制成细胞悬液涂片，风干后丙酮固定15min；3%过氧化氢孵育5min，以阻断内源性过氧化物酶；滴加一抗（稀释1∶100），室温90min，PBS冲洗，2min×3次；滴加IgG抗体-HRP多聚体20～30 min，PBS冲洗，5min×3次；用DAB溶液显色；蒸馏水冲洗、苏木素衬染、脱水、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果分析：P53蛋白定位于胞核，细胞核染呈棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。Bcl-2蛋白定位于胞膜或胞浆，细胞膜或细胞浆染呈棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。随机计数高倍镜下10个视野中的阳性细胞数和总细胞数，求出每组细胞的阳性率。
1.2.7 统计学方法 实验数据采用x±s表示，用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，参数统计采用t检验。
2 结果
2.1 ST提取液对Hela细胞增殖抑制的影响 细胞增殖抑制实验结果显示，药物处理Hela细胞48h后，ST各浓度组细胞增殖抑制率显著高于正常对照组（P均<0.01），且呈一定的剂量依赖性，见表1。
2.2 HDI对SPC-A-1凋亡细胞形态变化的影响 药物处理48h后，HDI各浓度组和DDP组细胞核形态明显发生变化，荧光显微镜观察可见细胞核固缩，染色质凝聚，染色加深，呈环形或新月形附于核膜周围。其中，50mg/L HDI 组和DDP组可观察到细胞核破碎，呈大小不等、形态不规则的碎片或呈梅花状。细胞核这些形态改变表明HDI能诱导肺癌SPC-A-1细胞凋亡，见图1。
表1 ST对Hela细胞增殖抑制率的影响（略）
与对照组比较，a:t=12.04，b:t=15.51，c:t=26.77，d:t=26.84，e:t=21.48，f:t=18.60，g:t=157.87，h:t=57.31，P均<0.01
A.正常对照组 B.0.5ml/L ST组 C.HBL 5ml/L ST组 D.50ml/L ST组 E.25mg/L DDP组
图1 SPC-A-1细胞凋亡的形态变化(×1000) （略）
2.3 ST对Hela细胞凋亡的影响 TUNEL检测结果显示，药物处理Hela细胞48h后，正常对照组、12.5ml/L ST组、25ml/L ST组、50ml/L ST组和DDP组的阳性细胞的百分率（即细胞凋亡率）分别为（3.08±0.15）%、(12.47±1.33)%、(19.53±2.04)%、(29.42±3.42)%和(49.15±3.28)%，ST各浓度组细胞凋亡率显著高于正常对照组（t分别为22.19，25.43，29.33，P均<0.01）。
2.4 ST对Hela细胞P53和Bcl-2蛋白表达的影响 免疫组化检测结果显示，ST处理Hela细胞48h后，与正常对照组比较，ST各浓度组P53蛋白表达显著增高（P均<0.01），Bcl-2蛋白表达明显下降（P均<0.01），见表2。
表2 P53和Bcl-2蛋白表达变化（略）
与对照组比较，a:t=6.07，b:t=6.16，c:t=11.56，d:t=13.77，e:t=5.30，f:t=8.11，g:t=19.56，h:t=28.75，P均<0.01
3 讨论
ST的茎和果实含有龙葵碱，全草主要含甾体生物碱，其性味苦、辛、微寒，具有清热利湿、解毒消肿、祛风化痰和抗癌等功效。施文荣等［4］研究表明，ST水提取液对HL-60肿瘤细胞既表现为短时间作用后的细胞杀伤，也表现为药物持续作用后的增殖抑制。孙立新等［5］研究了ST饮片乙醇提取物及不同溶剂萃取部分对肿瘤细胞的体外抑制作用，筛选出ST抗肿瘤活性部位。结果发现，ST饮片乙醇提取物、乙酸乙酯部位和正丁醇部位对肿瘤均有不同程度的抑制作用。乙酸乙酯部位对人黑色素瘤A375细胞和人宫颈癌Hela细胞抑制作用较强，正丁醇部位对A375细胞和Hela细胞抑制作用次之。本实验发现，ST水提取液对Hela细胞具有较强的细胞增殖抑制作用，且呈一定的剂量依赖性，ST各浓度组的Hela细胞抑制率显著高于正常对照组。表明一定浓度的ST提取液对人宫颈癌Hela细胞具有较强的杀伤能力。本实验经Hoechst 33342对Hela细胞进行荧光染色后，用荧光显微镜观察可见细胞核固缩，染色质凝聚，染色加深，呈环形或新月形附于核膜周围，或细胞核破碎，呈大小不等、形态不规则的碎片或呈梅花状。细胞的这些形态学变化证明了ST能诱导Hela细胞凋亡。因为细胞凋亡首先是一个形态学改变，细胞形态特别是细胞核形态变化为凋亡细胞最典型的特征，因此形态学变化不仅是判断凋亡细胞的基本参数，而且也是鉴定凋亡细胞最可靠的方法。同时，TUNEL检测结果显示，ST各浓度组细胞凋亡率显著于高正常对照组。表明ST抑制Hela细胞增殖的机制之一是通过诱导细胞凋亡而实现的。近年来，大量研究证明：细胞凋亡是多种基因互相作用、综合调节的结果［6］。细胞凋亡过程受凋亡促进基因P53、fas等和凋亡抑制基因如Bcl-2、survivin等共同调节［7］。肿瘤抑制基因是当前肿瘤遗传学及分子生物学的研究热点，其中P53基因是最重要的抑癌基因之一，与肿瘤关系最为密切。大量的研究证实：野生型P53是一种抑癌基因，能够在各种条件下诱导或促进细胞凋亡，而突变型则反而促进肿瘤发生，对细胞凋亡有抑制作用，成为癌基因。Bcl-2是一种调控死亡的“存活基因”，是一种广义的抑制凋亡基因。Bcl-2表达可抑制细胞凋亡，从而使细胞增殖和凋亡不平衡，对肿瘤的发生、与转移有一定的促进作用［8］。多种化疗药物及中药的抗肿瘤活性均与Bcl-2基因表达下调有关。本实验结果显示，随着ST提取液浓度升高，野生型P53蛋白表达明显增高而Bcl-2蛋白表达显著下降。提示ST诱导Hela细胞凋亡的机制可能与上调野生型P53蛋白表达和下调Bcl-2蛋白表达有关。其确切机制有待进一步研究。
【】
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