廿烷五稀酸对肺腺癌细胞的抑制作用实验研究

                 作者：尹曾，姚侠，石俊 ，韩光海，李明哲  　

［摘要］ ［目的］ 研究廿烷碳五烯酸（EPA）对肺腺癌细胞的抑制增殖作用. ［方法］ 在细胞培养、动物实验及临床应用实验基础上，进行细胞凋亡、肿瘤细胞活力及急性毒性实验. ［结果］ EPA对肺腺癌细胞具有明显地抑制增殖作用，EPA作用后肺腺癌细胞周期的G 1 ，S期细胞百分率明显降低，随时间的延长及剂量增大而效能增强;EPA可引起细胞凋亡;EPA作用后血清TNF-α，IL-6，IL-1水平显著降低. ［结论］ 长期接受EPA可调节机体炎症反应，提高机体免疫力，而且单剂量应用即具有抑制肿瘤细胞生长的作用，呈时间-剂量依赖性.

    ［关键词］  廿烷五稀酸;细胞凋亡;细胞因子;肺腺癌

    ABSTRACT:OBJECTIVE To study of inhibitory effects of of EPA to the adenocarcinoma of lung cell.METHODS Based on cell developing，animal test and clinic test，the cell apoptosis and cancer cell vitality and acute poison tests were used.RESULTS EPA obviously depress and kill adenocarcinoma of lung cell EPA working on adenocarcinoma of lung cell life circle，and EPA works on adenocarcinoma and the more dose EPA works on，the better affect of cell apoptosis.The level of TNF-α，IL-6，IL-1obviously step down than control group.CONCLUSION Long time received EPA treatment can accommodate body inflammatory reaction，not only enhance body immunity.Single dose application can suppress tumor cell growth and vitality，and it shows time and dose dependent.

    Key words:eicosapentaenoic;acid;apoptosis;cytokine;adenocarcinoma of lung

    肺癌是世界上发病率和死亡率均较高的疾病之一，近年来分子生物学技术的应用使肺癌相关研究有了较大的进展.自20世纪80年代始，大量的实验研究结果表明EPA与机体免疫及抗肿瘤密切相关.本实验通过将EPA作用于人肺腺癌细胞株LA795，探讨了EPA对肺腺癌细胞的抑制增殖作用.

    1 材料与方法

    1.1 材料  实验所用EPA为cis-5，8，11，14，17-EPA，为美国Sigma公司产品，分子式为C 20 H 30 O 2 .将EPA用无水乙醇溶解为10mmol/L，封存于真空瓶中，置-70℃冰柜中备用.人肺腺癌细胞株LA795由医学院肿瘤研究所提供.实验动物取Balb/c纯系小鼠，鼠龄为5～6周，体重为18～22g，雌雄兼用.培养基为含100mL/L小牛血清的RPMI1640;胰蛋白酶和端粒酶活性检测试剂盒为华美生物工程公司产品;三磷酸腺苷为齐齐哈尔市第二制药厂产品.TNF-α用RIA试剂盒（北京邦定生物医学公司）测定，IL-6，IL-1用ELISA试剂盒（美国Genzyme公司）测定.

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养  将肺腺癌细胞株LA795用含小牛血清的RPMI1640培养液培养，置于50mL/L二氧化碳、37℃的培养箱中进行传代培养.

    1.2.2 裸鼠人肺癌模型的建立  将已制备成细胞悬液的LA795（5×10 10 个/L），取0.2mL注射于裸鼠背部皮下，取肿块平均直径达1.0cm，肿瘤无自发性出血、坏死及感染病灶的裸鼠作为实验对象. 1.2.3 三磷酸腺苷氯化镁的配制  出每支三磷酸腺苷及氯化镁的摩尔浓度 ［1］ ，使用前按4.76∶1.00（V/V）混合，使之成为等摩尔浓度的混合液（13.6mmol/L），备用.

    1.2.4 细胞的处理及实验分组  将肺腺癌细胞LA795用含小牛血清（100mL/L）和抗生素（10万U/L青霉素和100mg/L链霉素）的RPMI1640培养基分别种植在25mL细胞培养瓶盒6孔板中，在37℃含50mL/L二氧化碳的培养箱中培养，反复传10代，待细胞性能稳定后加药进行实验.实验取64只小鼠，雌雄兼用，分为4个组，即EPA组、三磷酸腺苷氯化镁（ATP-MgCl 2 ）组、氯化镁组及空白对照组，每组各为16只.

    1.2.5 细胞增殖抑制率的测定  将实验用6孔板作为培养皿，每孔加入等量肺腺癌细胞培养24h，大部分细胞贴壁后加入试剂，加药前后每日均用2.5g/L胰蛋白酶消化，充分吹打，使细胞均匀漂浮在培养液中，经台盼蓝染色后记数活细胞，每组测3孔，每孔计数4次，连续4d，绘制生长曲线，计算出细胞增殖抑制率，其公式如下:

    细胞增殖抑制率=（1-实验组细胞数对照组细胞数）×100%

    1.2.6 细胞周期时相中DNA含量测定  将人肺腺癌细胞株LA795置入50mL细胞培养瓶中，置于37℃二氧化碳孵箱内培养.当细胞处于对数生长期时，调节细胞数为1×10 9 个/L，分别加入终浓度为0.25，0.50，1.00g/L的EPA，同时设空白对照组，继续培养24，48h后分别收集细胞，用流式细胞仪检测，记录细胞周期的时相比例，并根据DNA含量组方图中的AP亚峰细胞百分率计算凋亡小体百分率.

    1.2.7 EPA作用时间及剂量对生存时间的影响  取64只小鼠随机分组，其中非荷瘤（NTB）组为8只，荷瘤非治疗（NT）组为8只，荷瘤生理盐水对照（NST）组为16只，EPA1mmol/L治疗（EPAT）组为32只.于接种后第8日处死NT组、第20日处死NST，EPAT组各8只小鼠，其余未处死的NST组8只和EPAT组24只小鼠则用于继续观察EPA治疗时间及不同剂量（1，10，20mmol/L）对小鼠生存时间的影响.自接种后第14日开始，给予EPAT组小鼠每日1次腹腔内注射EPA1mL，连续治疗6d.NST，NTB组小鼠给予等量生理盐水.

    1.2.8 统计学处理  应用SPSS统计软件进行多组间差异方差分析，各组实验数据以均数±标准偏差（x±SD）表示.

    2 结果

    2.1 肺腺癌细胞生长的变化  EPA，ATP-MgCl 2 对肺腺癌细胞均有显著的抑制增殖作用，与氯化镁组及空白对照组比较差异有统计学意义（P< 0.01），见表1.  表1 EPA，ATP-MgCl 2 及氯化镁对细胞数的影响

    2.2 EPA对肺腺癌细胞周期的影响  EPA作用后肺腺癌细胞周期的G 1 ，S期细胞百分率明显降低，且随着EPA作用时间的延长和剂量增大而更加明显，提示EPA可引起细胞凋亡，见表2.表2 EPA对细胞周期的影响

    2.3 细胞因子的变化  随着肿瘤质量的增加，血清TNF-α，IL-6，IL-1水平相应升高.NT组小鼠的TNF-α，IL-6，IL-1水平均显著高于NTB组.在第20日，NST组小鼠的TNF-α，IL-6，IL-1水平较接种后第8日处死的NT组升高更为明显，但差异无统计学意义.在6d后，EPAT组上述指标均不同程度地降低，与NST组比较差异有统计学性意义，见表3. 表3 EPA治疗6d后4组小鼠细胞因子的变化*与NTB组比较，P<0.05;△与NST组比较，P<0.01

　　3 讨论

    流行病学调查资料显示，恶性肿瘤的发生与摄入脂肪的种类和数量关系密切，经常食用富含EPA的深海鱼及其他海产品的人群发生恶性肿瘤的危险性明显降低 ［2，3］ .imonsen等报道，癌细胞和正常组织在脂质代谢上有着根本的区别，而不饱和脂肪酸在抗肿瘤的同时不伤害正常组织;实验研究亦证实n-3系列不饱和脂肪酸可抑制肿瘤的生长、侵袭及转移，增强某些抗癌药物的疗效，改善癌性恶病质状况，延长荷瘤宿主的生存时间 ［4～8］ .本实验结果示，EPA及ATP-MgCl 2 对体外培养人肺腺癌细胞生长均有显著地抑制增殖作用，提示EPA具有抗人肺腺癌细胞的作用.据报道，EPA具有增强细胞免疫和提高特异性抗体生成的作用，本研究结果表明EPA明显抑制肺腺癌细胞周期的转换，使G 1 期细胞明显减少，S期细胞相对增多.G 1 期又称细胞复制前期，系有丝分裂完成到DNA复制前期，在此期制造产生rRNA，mRNA，tRNA核蛋白体.本实验结果表明，TNF-α，IL-6，IL-1影响肿瘤机体免疫力，进而导致厌食、体重减轻和代谢紊乱等.EPA通过抑制TNF-α，IL-6，IL-1水平的升高，改善肿瘤机体免疫力，提高生存时间.综上所述，长期接受EPA治疗可调节机体炎症反应，提高机体免疫力，而且单剂量应用即有抑制肿瘤细胞的增殖，其作用呈时间-剂量依赖性.

　　［参 考 文 献］

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    ［2］ Terry PD，Rohan TE，Wolk A.Intakes of fish and ma-  rine fatty acids and the risks of cancers of the breast and prostate and of other hormone-related cancers:a review of the epidemiologic evidence［J］.Am J Clin Nutr，2003，77（3）:532.

    ［3］ Terry PD，Rohan TE，Wolk A.Long-chain（n-3）fatty acid intake and risk of cancers of the breast and the prostate:recent epidemiological studies，biological mech-anisms，and directions for future research［J］.J Nutr， 2004，134（suppl）:3412S.

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