脂联素基因单核苷酸多态性与2型糖尿病的相关性研究

【摘要】  ［目的］探讨脂联素基因H241P突变与2型糖尿病的关系［方法］随机选取377例无亲缘关系的吉林省延边地区朝鲜族和汉族人群，其中糖耐量正常者为195名，2型糖尿病患者为182名；行口服葡萄糖耐量实验，于实验前及实验后2h时检测血糖；用体重指数及腰臀比值评估体脂肪含量及分布；采用聚合酶链反应?单链构象多态性方法对apM1基因突变进行初筛分析，并对异常带型标本进行基因序列测定［结果］在研究对象中发现脂联素基因H241P突变者为1例，属于2型糖尿病组，突变频率为0.5%［结论］脂联素基因H241P突变可能不是2型糖尿病的易感因素.

【关键词】  糖尿病 2型 脂联素 突变

    Relationship between adiponectin gene polymorphism and type  2  diabetes mellitus

     ABSTRACT:OBJECTIVETo investigate the relationship between the H241P mutation in the adiponectin gene (apM1) and type 2 diabetes(T2DM)METHODSThe studied population was consisted of 377 Han nationality and Korean?Chinese residents in Yanbian area, Jilin province, in witch 195 cases of normal glucose tolerance (NGT) and 182 cases of T2DM. Plasma glucose was measured at 0 and 2h during oral  glucose tolerance test. The content and distribution of body fat was evaluated by the body mass index (BMI) and waist to hip ratio (WHR). The screening for mutation of apM1 gene was performed by polymerase chain reaction single strand conformation polymorphism (PCR?SSCP), and then the exact mutation was checked by automated DNA direct sequencingRESULTSThe H241P mutation was found in one case of T2DM and the mutation frequency was 0.5%CONCLUSIONH241P mutation in apM1 gene was not susceptibility of gene for T2DM.

    Key words:diabetes mellitus，　　type 2；adiponectin；mutation

    脂肪组织不仅是能量储存组织，而且亦是控制能量平衡的内分泌器官，在代谢状态改变及受外来刺激时它可分泌多种具有生理活性的蛋白质脂肪细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF?α)、瘦素、抵抗素及脂联素(adipose most abundant gene transcript 1, apM1)等.apM1参与糖和脂肪代谢的调节，增加胰岛素敏感性，并具有消炎及抗动脉硬化作用.研究结果表明，在胰岛素抵抗状态下，体内的apM1水平与胰岛素的敏感性呈正相关，而在2型糖尿病、肥胖症及冠心病患者的血液中apM1水平则降低［1］，提示apM1与代谢综合征的发生密切相关.本研究从基因变异的角度探讨了apM1与2型糖尿病发生的相关性.

    1  对象和方法

    1.1  研究对象的选择及分组  所有被调查者均为吉林省延边地区的朝鲜族和汉族人群，彼此间无亲缘关系，且双亲连续三代为同一民族，人群相对比较稳定，遵循知情自愿的原则.根据1997年美国糖尿病学会（ADA）诊断及分型标准分组，即糖耐量正常组及2型糖尿病组.糖耐量正常组为195人，其中朝鲜族为97人，汉族为98人；年龄为39～60岁，平均为51岁；男性为92例，其中汉族为49例，朝鲜族为43例，女性为103例，其中汉族为51例，朝鲜族为52例.2型糖尿病组为182人，其中朝鲜族为90人，汉族为92人；年龄为40～61岁，平均为52岁；男性为79例，其中汉族为40例，朝鲜族为39例，女性为103例，其中汉族为51例，朝鲜族为52例.两组研究对象的民族、年龄及性别构成比间均无显著性差异，具有可比性.

    1.2  试剂  琼脂糖、PCR引物、PCR标记物、PCR反应试剂均为美国Promega公司产品；溴化乙锭为Amresco公司产品；DNA提取试剂盒为上海华舜生物工程有限公司/上海华尧核酸技术有限公司产品.

    1.3  方法

    1.3.1  生物化学指标与体脂肪含量及分布的测定  隔夜空腹10h后，行口服葡萄糖耐量实验，于实验开始及后2h时各取静脉血10mL，测定葡萄糖（氧化酶法）、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇；同时测量身高及体重，体重指数及腰臀比值，进行体脂肪含量及分布估测.

    1.3.2  DNA的提取及PCR扩增  取每个研究对象外周血1mL，置于ACD抗凝管中，-20℃保存备用.用小量基因组DNA提取试剂盒制备基因组DNA，4℃保存，经紫外分光光度计分别测定OD值，结果OD值在波长260～280nm范围内均大于1.6，提示DNA的纯度好，质量浓度均在200mg/L以上.从基因库中查人类apM?1基因序列，用Primer3软件进行在线引物设计，合成片段长度为394bp，上游引物为5′?GAA GGA CAA GGC TAT GCT C?3′，下游引物为5′?GAG GAC TGG GAA CAT AGC A?3′.PCR反应体系：10×Buffer5μL；镁离子2μL；dNTP 1μL；上下游引物各为1μL；Taq酶5U；DNA模板300ng；用双蒸水补足至50μL，高速离心片刻（4℃），将样品混匀后置入 PCR（PTC?100）热循环仪上进行扩增.扩增参数：95℃预变性5min，95℃变性1min ，59℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环后于72℃延伸7min.PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下检测扩增结果（图1）.

    1.3.3  单链构象多态性(SSCP)分析及DNA序列测定  配制55g/L聚丙烯酰胺凝胶，取10μL PCR产物，加入10μL甲酰胺变性剂，98℃水浴7min，取出后立刻冰浴2min，取10μL上样，在4℃室温120V电压条件下电泳5h，100mL/L乙醇固定5min，蒸馏水漂洗2次，浸入100mL/L硝酸脱色10min，蒸馏水水洗2次，2g/L硝酸银染色25min，蒸馏水水洗3～5次，含0.3g/L甲醛的15g/L碳酸钠显色，可见清楚条带时用100g/L冰乙酸终止反应.蒸馏水漂洗后干胶拍照.将带型异常的PCR产物纯化后进行基因序列测定.

    2  结果

    2.1  PCR?SSCP分析及基因序列测定  在对377例研究对象的PCR扩增结果的SSCP分析中发现1例变异带型（图2），序列测定结果发现apM1 +722bp（以起始密码子腺嘌呤为＋1）处存在A/C杂合突变，密码子由CAT（His,H）变成CCT（Pro,P）,导致H241P错义突变（图3）.

    2.2  H241P突变与临床变量的关系  H241P变异带型研究对象属2型糖尿病组，汉族女性，突变频率为0.5%(表1)，体重指数为26.1，腰臀比值为0.92，血压及甘油三酯值均高于正常值.表1  糖耐量正常组及2型糖尿病组apM1基因H241P基因型及等位基因的分布

    3  讨论

    apM1是1995年由Scherer等发现的脂肪组织特异性胶原样细胞因子，亦称Acrp30， AdipoQ，GBP28,是一种血浆激素蛋白［2］.人apM1基因是单拷贝基因［3］，全基因组扫描显示定位于染色体3q27，而2型糖尿病和代谢综合征的易感位点也在3q27上［4］.apM1基因全长约为17kb，由3个外显子和2个内含子组成［5］，编码序列起始于外显子2，启动子区未发现有TATA盒.apM1由244个氨基酸组成，相对分子质量为28ku,包括氨基端的1个分泌信号序列，1个小的非螺旋区，1段22个胶原样的重复序列及羧基端的1个球形结构，后者为其主要的功能部位，而H241P突变位于此部位.在日本人中也存在H241P突变，但在法国人中却未发现该突变［6］，可见H241P突变具有种族异质性.本研究运用PCR?SSCP技术检测了延边地区朝鲜族及汉族人群apM1基因的H241P突变，结果见其频率在2型糖尿病组及糖耐量正常组间无显著性差异，提示H241P突变与2型糖尿病可能无显著相关性.总之，apM1基因H241P突变可能不是2型糖尿病的易感因素.

【】
  ［1］ Weyer C, Funahashi T, Tanaka S, et al..Hypoadiponectinmia in obesity and type 2 diabetes:close association with insulin resistance and hyperinsulinemia［J］.J Clin Endocrind Metab,2001,86:1930.

［2］ Scherer PE, Williams S, Fogliano M, et al..A novel serum protein to C1q, produced exclusively in adipocytes［J］.J Biol Chem,1995,270:26746.

［3］ Saito K, Tobe T, Minoshima S, et al..Organization of the gene for gelatin?binding protein (GBP28)［J］.Gene,1999,229(1?20):67.

［4］ Kissebah AH, Sonnenberg GE, Myklebust J, et al..Quantitative trait loci on chromosomes 3 and 17 infiuence henotypes of the metabolic syndrome ［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:14478.

［5］ Takahashi M, Arita Y, Yamagata K, et al..Genomic structure and mutation in adipose?specific gene,adiponectin［J］.Int J Obes,Relat Metab Disord,2000,24:861.

［6］ Vasseur F, Helbecque N, Dina C, et al..Single nucleotide polymorphism haplotypes in the both proximal promoter and exon 3 of the APM1 gene modulate adipocyte?secreted adiponectin hormone levels and contribute to the genetic risk for type 2 diabetes in French Caucasians［J］.Hum Mol Genet,2002,11:2607