抗乙酰胆碱受体单链抗体酵母表达的特性鉴定

【摘要】  ［目的］探讨毕赤酵母GS115表达的重症肌无力单链抗体A7的一般特性及与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的结合特异性［方法］采用SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹试验，检测已经转化至毕赤酵母GS115中的重症肌无力重组载体pPIC9K?ScFv A7表达的单链抗体A7蛋白的分子质量；应用间接免疫荧光技术确定表达蛋白与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的亲和性［结果］毕赤酵母GS115培养上清液中有目的蛋白的表达，分子质量约为44ku；间接免疫荧光试验显示，在大鼠肋间肌细胞间有荧光出现［结论］单链抗体A7可以在毕赤酵母中成功地表达，并且可与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体结合.

【关键词】  单链抗体 受体 胆碱能 重症肌无力

    ABSTRACT:OBJECTIVETo determine the specificity of expressed single chain variable fragment (ScFv) A7 of antibody against acetylcholine receptor (AChR) in myasthenia gravis in Pichia pastorisMETHODSThe molecular weight of expressed protein (ScFvA7) was analyzed by sodium dodecyl sulfate?olyacrylamide gel electrophoresis (SDS?AGE) and Western blotting. The affinity of expressed protein to AChR in mouse intercostals muscles was detected using indirect immunofluorescence technologyRESULTSThe target protein was secreted in the supernatant of expression culture medium. Its molecular weight was about 44ku. There was fluorescence between the mouse intercostals muscle cellsCONCLUSIONThe target protein has been expressed from Pichia pastoris GS115 successfully and it can bind to the AChR in mouse intercostals muscles.

    Key words:single chain variable fragment;receptor, cholinergic;myasthenia gravis

    重症肌无力是抗乙酰胆碱受体抗体介导的自身免疫性疾病，目前对它的主要以非特异性免疫治疗为主，此方法虽然可以在一定程度上减轻患者的临床症状，降低死亡率，但可引起广泛的免疫抑制等严重的副作用.特异性免疫治疗还处于动物实验阶段，包括口服或经鼻黏膜给予乙酰胆碱受体诱导免疫耐受，导入融合FasL基因的抗原提呈细胞以杀伤反应性T细胞，而T细胞表位多肽疫苗抑制自身反应性T细胞的增殖，单价抗体特异性封闭抗原，以乙酰胆碱受体为配基制备免疫吸附剂，以去除血液中的致病性抗体等［1～3］.由致病性抗体制备的单链抗体（single chain variable fragment, ScFv）与乙酰胆碱受体的主要免疫原区结合后可特异性地封闭致病性抗体的结合位点，阻止乙酰胆碱受体发生抗原调变，同时由于单链抗体没有可结晶片段（Fc段），无法激活补体，可以起到保护性作用［4］.由于单链抗体分子质量更小，易于穿过血管壁进入组织，且易于基因操作，因此对它的研究逐渐被受重视.抗乙酰胆碱受体单克隆抗体A7为高致病性抗体［5］，由它制备得到的单链抗体A7应仍然保留着与乙酰胆碱受体较高的结合活性，并能够抑制致病性抗体对乙酰胆碱受体的结合.本实验的目的是探讨单链抗体A7在毕赤酵母表达产物的特性，对重症肌无力的基因治疗研究提供实验依据.

    1  材料与方法

    1.1  实验动物及试剂  实验动物取Wistar大鼠，由延边大学医学部实验动物科提供.考马斯亮蓝为美国Sigma公司产品，G?418、牛血清白蛋白（BSA）及生物素为华美生物工程公司产品，150g/L Next?Gel蛋白电泳溶液及吐温?20（Tween?20）为Amresco公司产品，鼠抗c?myc单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，辣根过氧化物酶、异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠抗体、二氨基联苯氨（DAB）染色液及PBS为北京鼎国公司产品.

    1.2  重组表达载体pPIC9K?ScFv A7的构建及表达  由延边大学基础医学院免疫学与病原生物学研究室构建并表达.应用聚合酶链反应技术构建重组表达载体pPIC9K?ScFv A7，用SalⅠ酶切质粒pPIC9K?ScFv A7使之线性化后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，经斑点杂交试验检测证实已有单链抗体表达.

    1.3  单链抗体A7表达产物的一般特性鉴定

    1.3.1  含有重组表达载体pPIC9K?ScFv A7酵母的培养  将携带有重组基因表达载体的毕赤酵母GS115复苏后，利用抗生素G?418筛选高拷贝重组子，用YPD培养基传代培养，再经BMGY，BMMY表达培养基培养3d，每24h添加纯甲醇使甲醇终质量浓度为10mL/L诱导表达.在108，120，132h时取样5mL，以14000r/min离心5min，取上清液经低温浓缩后于4℃保存备用.

    1.3.2  SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳  取20μL浓缩样品（上清液）和等体积的2×SDS上样缓冲液混匀，于沸水中变性5min，制备聚丙烯酰胺凝胶，上样40μL，190V电泳2h.将凝胶放入考马斯亮蓝染色液中室温摇动染色30min.阴性对照用GS115/pPIC9K代替GS115/pPIC9k?ScFv A7蛋白样品.

    1.3.3  蛋白印迹试验  90V转印2h.移出硝酸纤维素膜，用去离子水冲洗数次，将洗涤后的硝酸纤维素膜放入盛有100mL PBS?20g/L脱脂干奶染缸中，室温摇动封闭2h，弃掉90mL上述液，加入30mL鼠抗c?myc单克隆抗体，置于4℃过夜，用PBS?0.5g/L Tween?20液洗涤3次，再用PBS洗涤2次，每次室温摇动5min，加入30mL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，室温摇动反应2h，再用PBS?0.5g/L Tween?20液洗涤3次，再用PBS洗涤2次，每次室温摇动5min，加入底物DAB溶液3mL，室温摇动反应30min，倒掉底物溶液，用去离子水冲洗5～10次，将硝酸纤维素膜取出，用滤纸吸干.阴性对照用GS115/pPIC9K代替GS115/p　PIC9k?ScFv A7蛋白样品.

    1.4  单链抗体A7表达产物的特异性鉴定  应用间接免疫荧光技术.取体重为200g的Wistar大鼠的肋间肌，行OCT包埋，常规冰冻切片，在标本处滴加10mmol/L PBS（pH7.4），10min后弃去，滴加40μL牛血清白蛋白，室温下反应15min，滴加40μL 120h酵母培养浓缩上清液覆盖标本，室温下反应2h，用10mmol/L PBS（pH7.4）冲洗1,2次，浸洗3次，每次5min，不断摇动，弃掉上述液并晾干，滴加40μL鼠抗c?myc单克隆抗体，室温下反应2h，用10mmol/L PBS（pH7.4）冲洗1，2次，浸洗3次，每次5min，不断摇动，晾干后滴加异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠抗体溶液，室温下反应2h，再次洗涤晾干，滴加1滴缓冲甘油，覆以盖玻片封片.阴性对照用GS115/pPIC9K代替GS115/pPIC9k?ScFv A7蛋白样品.用荧光显微镜在蓝光下观察标本，照像.

    2  结果

    挑取已经整合至酵母GS115的重组载体pPIC9K?ScFv A7的阳性转化子在甲醇诱导下进行表达，经SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白印迹试验检测发现，含有单链抗体A7基因的酵母上清液中出现单链抗体A7的表达，在阴性对照酵母培养上清液中无抗体的表达（Fig1）.间接免疫荧光技术检测结果显示，在大鼠肋间肌细胞膜周围有绿色荧光出现，而GS115/p PIC9K阴性对照则无荧光出现抗乙酰胆碱受体抗体与神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体结合，可激活补体使突触后膜乙酰胆碱受体遭到破坏，导致肌肉收缩无力，出现重症肌无力的症状.引起重症肌无力的病因目前还不清楚，但若给动物免疫乙酰胆碱受体或注射抗乙酰胆碱受体抗体，动物可发生实验性自身免疫性重症肌无力［6，7］.真核表达载体pPIC9K?ScFv A7是在重组质粒pHEN2?ScFv A7［8］上扩增出单链抗体A7基因，并与纯化的真核表达载体pPIC9K连接而成，单链抗体A7基因末端连接有c?myc标签基因，这一基因可与单链抗体A7基因一起表达.因而，鼠抗c?myc单克隆抗体可以与表达的蛋白结合，并且羊抗鼠抗体可与鼠抗c?myc单克隆抗体结合，从而有利于表达产物的鉴定.选择108，120，132h时的阳性转化子培养上清液经SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳检测发现，在分子质量为44ku处出现了条带，而阴性对照在相应位置上则未见条带.测定的表达蛋白的分子质量与理论值29ku的分子质量相比稍大一些，提示有糖基化现象，因为甲醇酵母普遍会对表达蛋白进行糖基化修饰，多为N?连接的糖链，814个甘露糖加于特征性序列Asn?Xaa?Thr/Ser(Xaa≠Pro)的Asn上［9］.采用培养108，120，132h时的阳性转化子的上清液与大鼠肋间肌冰冻切片孵育，使上清液中的表达蛋白充分与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体结合，再与鼠抗c?myc单克隆抗体结合后加入羊抗鼠荧光抗体.本实验结果表明，在肋间肌细胞膜周围有绿色荧光出现，而GS115/p　PIC9K阴性对照则无荧光出现，提示所分泌的目的蛋白保留了单链抗体与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的亲和性，这一结果有重要意义，因为在以后应用单链抗体重症肌无力中，单链抗体必须可与肌肉中固定的乙酰胆碱受体结合，才能竞争性抑制致病性抗体对乙酰胆碱受体的结合.本实验对酵母表达的单链抗体A7进行了一般特性和特异性的鉴定，为今后研究单链抗体A7治疗重症肌无力研究提供了实验依据.

【】
  ［1］ Wu JM, Wu B, Miagkov A, et al..Specific immunotherapy of experimental myasthenia gravis in vitro:the “guided missile” strategy［J］.Cell Immunol,2001,208(2):137.

［2］ Paas?Rozner M, Sela M, Mozes E.The nature of the active suppression of responses associated with experimentale auto?immune myasthenia gravis by a dual peptide ligand administered by different routes［J］.Proc Nad Acad Sci USA,2001,98(22):12642.

［3］ Araga S, Xu L, Nakashima K, et al..A peptide vaccine that prevents experimental autoimmune myasthenia gravis by specifically blocking T cell help［J］.FASEB J,2000,14(1):185.

［4］ Park SS, Ryu CJ, Kang YJ, et al..Generation and characterization of a novel tetravalent bispecific antibody that binds to hepatitis B virus surface antigens［J］.Mol Immunol,2000,37(18):1123.

［5］ 孟繁平，杨康鹃，Graus Y,等.AChR单抗（A7）诱导大鼠的实验性重症肌无力的分子基础［J］.中华微生物学和免疫学杂志，1996，16（1）：45.

［6］ Meng F, Stassen M, Schillberg S, et al..Construction and characterization of a single chain antibody fragment derived from thymus of a patient with myasthenia gravis［J］.Autoimmunity,2002,35:125.

［7］ De Baets M, Stassen M.The role of antibodies in myasthenia gravis［J］.J Neurol Sci,2002,202:5.

［8］ 金桂花，王玉祥，范华英，等.重症肌无力抗乙酰胆碱受体单链抗体基因的构建［J］.延边大学医学学报，2004，27（3）：162.

［9］ Cereghino JL, Cregg JM.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris［J］.FEMS Microbiol Rev,2000,24(1):45