罗格列酮对小鼠Ⅱ型葡萄糖载体mRNA表达的影响

【摘要】  ［目的］ 探讨罗格列酮对小鼠Ⅱ型葡萄糖载体（mGLUT2）mRNA表达的影响［方法］采用分子克隆技术将过氧化物酶体增殖物受体γ(PPARγ)、维甲酸类受体X(RXRα)及mGLUT2 cDNA分别克隆到表达载体pCMX和pGL3b上.PPARγ，RXRα，mGLUT2克隆载体转染NIH 3T3细胞，处理或不处理罗格列酮，应用荧光素酶活性测定法及RNA印迹方法等测定罗格列酮对mGLUT2重组体荧光素酶活性调节及对mRNA表达的影响［结果］罗格列酮可激活mGLUT2重组体荧光素酶的活性，亦可增加mRNA的表达水平［结论］罗格列酮可增强mGLUT2的表达，可能参与PPARγ对mGLUT2的调节过程.

【关键词】  葡萄糖转运蛋白质类 易化性 RNA 信使 罗格列酮

    ABSTRACT:OBJECTIVETo understand the possibility of effect of the Rosiglitazone on mouse glucose transporter Ⅱ(mGLUT2) mRNA expressionMETHODS PPARγ, RXRα and mGLUT2 cDNA clone into pCMX and pGL3b expression vector. The recombinant DNA transfected into NIH 3T3 cells, treated the rosigiltazone and confirm the mGLUT2 activity and mRNA expression by the Rosiglitazone through PPARγ activation with luciferase assay and Northern blotRESULTSThe Rosigiltazone activates the mGLUT2 activity and increase the mGLUT2 mRNA expression through PPARγ activationCONCLUSIONThe Rosigiltazone perhaps binds to PPARγ and regulations mGLUT2 mRNA expression.

    Key words:glucose transport proteins, facilitative;RNA messenger;rosigiltazone

    mGLUT2在胰岛及肝脏等组织中表达，而GLUT2在多种病理状态下有较高水平的表达，但其机制不详.罗格列酮是核转录因子?过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）的配体，PPARγ和配体结合被激活后，可与维甲酸类受体X(RXRα)形成二聚体，再与PPARs反应元件(PPRE)结合而发挥转录调控作用，PPRE存在于许多编码与糖及脂类代谢相关的蛋白质的DNA上游序列.为探讨罗格列酮是否是通过激活PPARγ参与mGLUT2的表达调节，进而参与组织吸收葡萄糖的过程,达到降低血糖的目的,本实验利用分子克隆技术构建了PPARγ，RXRα，mGLUT2的表达载体系统，将其转染NIH 3T3细胞后处理罗格列酮，通过荧光素酶活性测定和Northern blot等实验方法观察了罗格列酮对mGLUT2活性及对mRNA表达的调节作用.

    1  材料和方法

    1.1  材料  NIH 3T3细胞株购自ATCC公司；pCRⅡ?TOPO载体(Life Technologies, Gaithersburg, MD)，Dulbecco′s modified Eagle′s培养液(DMEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD)，LipofectAMINE PLUS试剂 (Life Technologies, Gaithersburg, MD)，OPTI?MEN I(Life Technologies, Gaithersburg,MD)，裂解缓冲液(Promega,Madison,WI)、荧光素酶测定试剂 (Promega)及TRIzol○R试剂(Life Technologies, Gaithersburg，MD)均为美国产，层析柱为德国产(Qiagen,Hilden).

    1.2  方法

    1.2.1  重组体的构建  mGLUT2启动子的5′侧翼?732碱基区间利用2对引物，即上游引物为5′?CAT TGC TGG AAG AAG CGT ATC AG?3′，下游引物为5′?GGA GAC CTT CTG CTC AGT CGA CG?3′,内参GAPDH上游引物为5′?ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC?3′，下游引物为5′?GGA GAC CTT CTG CTC AGT CGA CG?3′，用PCR扩增后将扩增片段插入到pCRⅡ?TOPO 载体.pCRⅡ?mGLUT2?732用KpnⅠ/BamHⅠ内切酶内切后将片段亚克隆到KpnⅠ/BamHⅠ内切的pGL3b载体上,构建重组体pmGT2.用相同的方法构建重组体pCMX?PPARγ(Pg),pCMX?RXRα(Ra).利用DNA碱基序列测定法确定重组体序列.

    1.2.2  瞬间转染方法及荧光素酶活性测定  利用层析柱对质粒DNA进行提取纯化.细胞培养直至细胞数达到1×106个/孔.细胞经过20h培养吸附过程后，利用LipofectAMINE PLUS试剂进行转染，3h后更换培养液DMEM,同时在实验组培养液中添加罗格列酮（1mg/L），继续培养18h，用裂解缓冲液裂解细胞，经离心沉淀裂解细胞后收集上清液，进行荧光素酶活性测定，蛋白定量测定用Bradford法进行.荧光素酶活性和裂解液的蛋白浓度之比作为荧光素酶相对活性.每个转染实验都进行3组3次实验

    1.2.3  RNA印迹法  利用TRIzol○R试剂从实验组及对照组的NIH 3T3细胞中提取总RNA.取20μg总RNA在含有50g/L甲醛的10g/L变性琼脂糖中行电泳，将RNA转移至尼龙膜上行UV交联.将尼龙膜置于杂交缓冲液中进行预杂交，然后在65℃条件下与mGLUT2和GAPDH的探针(上游引物末端标记P32)杂交2h.杂交完毕后将尼龙膜置于37℃条件下用2×SSc，1g/L SDS冲洗15min，共2次，再用0.2×SSc，1g/L SDS冲洗.将尼龙膜放置在胶片下，置于-70℃冷冻箱内过夜.GAPDH作为内参对照.

    1.2.4  统计学处理  计量资料用均数±标准偏差(±SD)表示，采用t检验进行分析.

    2  结果

    2.1  Troglitazoen时NIH 3T3细胞中对mGLUT2活性的影响  为确定罗格列酮是否能够调节mGLUT2活性，将mGLUT2和PPARγ，RXRα重组体共转染NIH 3T3细胞，3h后更换培养液DMEM,同时在实验组培养液中添加罗格列酮（1mg/L），细胞继续培养18h，测定罗格列酮对mGLUT2活性的影响.结果表明，pmGT2的活性在PPARγ，RXRα的作用下可部分增强，在相同条件下添加罗格列酮后pmGT2的活性可增强7倍，提示罗格列酮可激活mGLUT2的活性，见图1.

    2.2  罗格列酮对NIH 3T3细胞mGLUT2 mRNA表达的影响  转染pCMX，PPARγ，RXRα，PPARγ，RXRα并添加罗格列酮的RNA印迹法实验结果显示，在体内条件下罗格列酮可增强NIH 3T3细胞中mGLUT2 mRNA的表达，见图2.  CONT:对照组；PgRa:PPARγ，RXRα转染NIH 3T3细胞；PgRaL:PPARγ，RXRα转染NIH 3T3细胞后添加罗格列酮

    3  讨论

    罗格列酮具有较好的降低血糖的作用［1,2］，该类药物的作用靶点是核转录因子，即过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）［3］，其亚型PPARγ(1，2型)是核转移因子，而PPRE存在于许多与糖及脂类代谢相关的蛋白质中［4］.罗格列酮是PPARγ的选择性激活剂，不仅可以通过激活PPARγ来降低血糖，亦可通过增强胰岛素敏感性来达到降低血糖的目的，故对2型糖尿病有较好的疗效［5］.GLUT2在胰岛及肝脏等组织中表达，这种载体对葡萄糖非常敏感［6］.为了观察罗格列酮对mGLUT2表达的影响，进而探讨这种载体在各种组织中的协同表达，达到降低血糖的目的，本实验通过DNA克隆、转染、荧光素酶活性测定及RNA印迹法等实验观察了mGLUT2的活性及mRNA的表达，结果表明罗格列酮可提高mGLUT2的活性，并可以使mGLUT2mRNA表达增强，提示罗格列酮可增加mGLUT2的表达，可能参与PPARγ对mGLUT2的调节过程.

【】
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［3］ Lehmann JM, Morre LB, Smith?Oliver TA.An antidiabetic thiazolidinedion is a high affinity ligand for peroxisome proliferator?activated receptor γ［J］.J Biol Chem，1995，270(22):12953.

［4］ Fajas I, Aubeceuf D, Raspe E, et al..The organization promoter analysis and expression of the human PPARγ gene［J］.J Biol Chem,1997,272:18779.

［5］ Day C.Thiazolidinedion:a new class of antidiabetic drugs［J］.Diabet Med,1999，16：179.

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