大鼠左冠状动脉不同结扎时间对心肌梗死面积及心功能的影响

                 作者：杨建业, 张迎春, 王明江, 唐俊明, 汤敏, 王家宁

  [摘  要]  目的: 探索大鼠左冠状动脉前降支不同结扎处理后，对心肌形态学及心功能的影响，以建立适合移植干细胞再生修复心肌梗死研究的稳定、可靠和更合乎发病机理的动物模型。方法:雄性Wistar大鼠 70 只，随机分为六组即：假手术组、结扎(15 min、30 min、45 min、60 min) 再灌、结扎非再灌。于处理后1 d、1周、2周或4周动态观察心肌梗死变化，并于处理一月后测量动脉收缩压（ASP）、动脉舒张压（ADP）、左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）及左室压力上升及下降最大速度（±dp/dtmax）。结果：引起明显的心肌梗死至少需要结扎30 min。结扎(45 min、60 min) 再灌、结扎非再灌的心肌梗死明显，并观察到梗死区域心肌已绝大部分纤维化，且梗死面积变化较恒定。同时测定不同结扎时间心功能的变化发现，结扎(45 min、60 min)再灌或结扎非再灌各组ASP、ADP、LVSP、±dp/dtmax显著下降，LVEDP明显升高。并且不同结扎时间处理后,大鼠心功能的变化与心肌梗死后的梗死面积变化密切相关。结论：建立了在实验大鼠左冠状动脉前降支中上1/3处结扎45 min以上的大鼠心肌梗死模型，不仅合乎临床心肌梗死的发病机理，而且梗死部位、梗死区域面积稳定，适合于移植细胞再生修复心肌梗死的研究。

    [关键词]  大鼠；心肌梗死；心功能；梗死面积

    Abstract: Objective To study the feasibility of establishment of myocardial  infarction models induced by different occlusion time course of left anterior descending(LAD) in rats, provide a considerably reliable model for the study of repair or rebuild rat myocardial infarction by stem cells transplantation. Methods Myocardial infarction was induced  by LAD occlusion in male Wistar rats. There is 60 male Wistar rats were randomly divided into six groups: acute LAD occlusion (15, 30, 45 or 60 min) with reperfusion or permanent LAD occlusion group. 1day, 1week，2weeks or 4weeks after different LAD ligation treatment, Pathological morphology, IS and mortality were be detected and analyzed. And 1month After LAD occlusion, We used multipurpose polygraph to measure heart rate(HR), left ventricular systolic pressure (LVSP), left ventricular end-diastolic pressure(LVEDP),±dp/dtmax, artery systolic pressure(ASP), artery diastolic pressure(ADP). Results The myocardial necrosis or infarction was formed by LAD occlusion for at least 30 minutes. Almost the same infarct area had formed in rats among occlusion (45 or 60 min) with reperfusion groups, or permanent occlusion group. However, when arterial blood flow was restored (occlusion with reperfusion), the scattered bleeding and cell damage in rat myocardial infarction area occurred. After permanent LAD occlusion or occlusion reperfusion, nearly 25% rats died of ventricular fibrillation within 4 hours, and most of them died within the first 30 minutes. The heart sections from rats of one day, one week, or one month after LAD occlusion showed the typical acute myocardial infarction pathological morphology. Compared to the LAD occlusion (15 or 30 min) with reperfusion group, ASP, LVSP and±dp/dtmax of  the LAD occlusion(45 or 60 min) with reperfusion or permanent LAD occlusion group were decreased, LVEDP increased. Conclusion Our findings suggest that rat acute myocardial infarction model is the most stable by LAD occlusion (at least 45 minutes) with reperfusion and this model is suitable for the research on stem cells transplantation.

    Key words: Rat; Myocardial infarction; Heart function; Infarct size

    　心肌梗死是由于冠状动脉闭塞，血流中断，导致部分心肌因严重而持久地急性缺血而发生的局部坏死。心肌梗死的大小、范围、严重程度主要取决于冠脉闭塞的部位、程度、速度和侧枝循环的沟通情况。临床上以左冠状动脉前降支闭塞最多见，可引起左心室前壁、心尖部、下侧部、前间壁和二尖瓣前内乳头肌梗死[1]。实验研究心肌梗死模型复制方法有药物、冷冻、结扎等方法[2-3]。干细胞移植心肌梗死的实验研究主要采用冷冻或结扎方法复制心肌梗死的模型。目前大多数学者采用冷冻法[4]。这种方法简单易行、制作的心肌梗死部位确切、面积易于掌握，与冠脉结扎制作的心肌梗死模型有相似性。但是冷冻法制作的心肌梗死模型与心肌梗死实际发病过程不相一致,不能很好地模拟临床心肌梗死和心衰的实际发病过程[2-5]。故本实验采用开胸手术结扎大鼠左冠状动脉前降支来模拟临床最常见的心肌梗死,使心肌梗死模型更符合实际发病过程,目的旨在为后续的移植干细胞再生修复心肌梗死的研究建立稳定、可靠和更合乎发病机理的动物模型。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物SPF级雄性Wistar大鼠 70 只，体重200±20 g，由湖北省实验动物中心提供（合格证：SCXK(鄂)2003-0005；实验许可证：SYXK(鄂)2004-0021；实验动物技术上岗证：鄂动资字 第420171号。动物在屏障系统环境下，用专用的饲料（购自湖北省实验动物中心）和灭菌饮用水分笼饲养。将其随机分为六组即：假手术组、结扎(15 min、30 min、45 min、60 min) 再灌、结扎非再灌组。

    1.2   试剂与仪器 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC，Fluka公司）;动物人工呼吸机（江西特力呼吸机设备公司）,心电图（ECG）（Nihon Koden）;恒低温切片机（AO），图像分析系统（成都泰盟），RM-6200型生理记录仪（成都仪器厂）。

    1.3   模型制作及评价取Wistar大鼠，经10%水合氯醛250 mg/kg腹腔注射麻醉。无菌条件下气管切开、插管、上动物呼吸机正压辅助呼吸(潮气量3 ml, 频率60 次/ 分)。胸部去毛，消毒，沿左锁骨中线纵行切开皮肤2 cm，在第四或五肋间钝性分离肌层，打开胸腔,剪开心包,轻压右侧胸廓，快速挤出心脏，在左冠状动脉前降支中上1/3处行结扎15 min、30 min、45 min或60 min后再灌以及结扎非再灌处理，随后把心脏放回胸腔。逐层关胸,待动物苏醒后拔气管插管。术后每只大鼠每天肌注青霉素10万U，维持1周。

    1.3.1  心功能检测：颈部正中切开，暴露并钝性分离左颈总动脉，用肝素（2  mg/kg）静脉注射肝素化后，将自制导管经左颈总动脉插入左心室，导管另一端连接压力传感器，通过多导生理记录仪同步记录左室收缩压（LVSP），左室舒张末压（LVEDP）及左室最大压力上升及下降速度（±dp/dtmax）。同样，股动脉插管测收缩压（ASP）、舒张压（ADP）。

    1.3.2  心肌梗死面积测定方法：心肌梗死后一月取出大鼠心脏。用生理盐水洗去血污，剔除血管脂肪等非心肌组织，用吸水纸吸去水分，将全心室置-20 ℃冻存5 min后，从心尖至心底横切成1～2 mm的心室组织切片，游离出每个左心室组织切片置于1%TTC溶液中，37 ℃温孵10 min，则非心肌梗死区染色为红色，梗死区不染色。在透明纸上描出轮廓，扫描后接入图像分析系统测定左室及梗塞区面积，并出梗死面积百分比。TTC染色后的心室肌组织用4%多聚甲醛溶液固定。梗塞面积%=左心室组织切片梗塞区面积/左心室组织切片总面积×100%

    1.3.3  病理组织学观察： 随机从各组心肌梗塞1 d、1周或4周后大鼠选出4~6只，麻醉后开胸，取出心脏，用生理盐水洗去血污,剔除血管脂肪等非心肌组织。置4%多聚甲醛溶液固定左心室组织切片8~12 h，入30%蔗糖直至标本沉底。恒冷切片机在注射点附近连续横切片，片厚10 μm，HE染色后镜检。

    1.3.4  统计分析：统计每组数据，数据以均数±标准差（x±s）表示。实验数据用SPSS10.0统计软件分析，组内比较：t检验；组间比较：方差分析；率的比较：Fisher确切概率法。P值＜0.05为有统计学意义。

    2  结果

    2.1  不同结扎时间对大鼠成活率的影响大鼠左冠状动脉前降支中上1/3处不同结扎时间处理后，观察一月内的成活率发现：结扎(60 min) 再灌组的大鼠成活率低于结扎(15 min、结扎30 min) 再灌组（P＜0.05)，而与其它组比较无差异。说明在左冠状动脉前降支中上1/3处结扎造成心肌梗死的情况下，结扎(45 min、60 min)再灌后两组大鼠的死亡率无差异（见表1）。表1   不同结扎时间对大鼠成活率的影响（略）  注：与结扎15 min、结扎30 min、结扎非再灌比较*P＜0.05；与结扎45 min比较P＞0.05

    2.2  心肌梗死病理过程的形态学观察大鼠左冠状动脉前降支中上1/3处结扎(15 min、30 min、45 min、60 min)再灌或结扎非再灌后1 d、1周、4周，取左心室冰冻切片，HE染色后，在低、高倍镜下观察各组大鼠左室心肌组织切片心肌形态学变化。结扎15 min再灌组只见非常少量的梗死灶。结扎(30 min、45 min、60 min)再灌或结扎非再灌各组，镜下见: 假手术组心肌未见异常(图1)。结扎后1 d大鼠心肌梗塞区边缘往往与周围心肌相互交错, 因而边界不清，并有大量炎症细胞从周围向梗塞区中央浸润，左心室壁厚度没有明显变化(图2) 。结扎后1周后可见左室前壁形成边界清楚的圆形梗死灶, 直径大小不等(1~3 mm) 、呈蜡黄色, 梗塞区心肌大量坏死, 坏死心肌结构紊乱，炎症细胞浸润明显减少，但有少量散在心肌残存，部分梗塞区出现肉芽组织,并伴随大量毛细血管增生，纤维化不明显(图3)。 4 周后, 梗塞区中央成纤维细胞逐渐减少, 肉芽组织逐渐被疤痕取代 (图4) 。左心室壁厚度，结扎(45 min、60 min)再灌和结扎非再灌各组（图5、6），均较假手术组和结扎(15 min、30   min)再灌组(图7、8)明显变薄。说明冠脉结扎45 min以上的大鼠心肌梗死病理变化过程更典型。

    2.3  不同结扎时间对大鼠心肌梗死面积的影响各组大鼠处理4周后，取左心室切成1~2 mm厚心室组织切片，TTC染色10 min后，显示非梗死区，心肌组织呈红色；梗死区不染色。在图像分析系统测定左心室梗塞区与左心室总面积比发现（表2）：冠脉结扎（45 min或60 min）再灌和结扎非再灌组大鼠左室梗塞面积及其占左室面积比较结扎（15 min或30 min）再灌的实验组明显增加（P＜0.05)，且结扎30 min再灌组内左室梗塞面积及其占左室面积百分比变异明显。说明冠脉结扎45 min以上的大鼠心肌梗塞面积变化恒定。表2  不同结扎时间的心肌梗塞面积变化(略) 注：与结扎15 min或30 min再灌组比较*P＜0.05

    2.4  心功能指标比较大鼠左冠状动脉前降支中上1/3处不同结扎时间处理后测定心功能发现（表3）：结扎(15 min、30 min)再灌组与结扎（45 min、60 min）再灌或结扎非再灌相比，后者ASP、ADP、LVSP、±dp/dtmax显著下降，LVEDP明显升高，P<0.05差异有显著性。说明心功能的变化与不同结扎时间处理引起心肌梗死程度不同密切相关。表3  心功能指标变化(略)   注:与 结扎（15 min或30 min）再灌组比较*P＜0.05

    3   讨论

　有关心肌梗死模型的制作，国内外采用结扎、药物、冷冻、栓塞等方法制作兔、大鼠、狗等不同动物的心肌梗死模型[5]，但大多数学者认为结扎法复制的心肌梗死模型与心肌梗死实际发病过程更符合。由于临床大多心肌缺血或心肌梗死都是一渐进性过程，会不断发生缺血或梗死后再灌现象。因此我们通过观察大鼠左冠状动脉前降支中上1/3处结扎不同时间后再灌或结扎非再灌的心肌梗死4周内的变化情况，以建立稳定的、适于细胞移植心肌梗死的大鼠动物模型。在本实验选择麻醉药过程中发现，用20%乌拉坦（7.0 ml/kg）、3%戊巴比妥钠（1.0 ml/kg）、盐酸氯胺酮（40 mg/kg）麻醉大鼠，大鼠在心肌梗死后苏醒时间超过4 h，而用10%水合氯醛（3.0 ml/kg）麻醉大鼠,大鼠一般在心肌梗死后2 h内苏醒。对于开胸结扎复制心肌梗死，为加快实验进度，需要尽快撤除人工呼吸机的支持以恢复自主呼吸。大鼠术后尽快苏醒显得更为重要。本实验采用10%水合氯醛（3.0 ml/kg）麻醉大鼠。行冠脉结扎法复制心肌缺血损伤模型，统计整个实验过程中各组成活率发现：结扎60 min再灌的大鼠成活率低于结扎（15 min或30 min）再灌、结扎非再灌，而与结扎45 min再灌比较无差异。其中，大约25%的实验大鼠死于结扎处理后24 h内，尤其死于结扎处理后2 h内为多。这与国外的报道相似[7-8]。本实验结扎非再灌的动物成活率（75%）与报道的66.7%不同，可能与我们模型制备后期护理有关，如采用外科手术术后一些护理管理，如：牛奶流质饮食1周，术后维持抗生素治疗1周有很大关系。本实验结果显示，结扎15 min几乎没有心肌梗死发生；引起明显的心肌梗死至少需要结扎30 min, 这与国外的报道相似[6]。在对结扎(30 min、45 min、60 min) 再灌、结扎非再灌大鼠的心肌梗死动态观察发现：心肌梗死1 d后切片观察有明显的心肌梗死;1周后, 梗塞区心肌大量坏死, 坏死心肌结构紊乱，有少量散在心肌残存，部分梗塞区出现肉芽组织,并伴随大量毛细血管增生，纤维化不明显;4周后, 梗塞区中央成纤维细胞逐渐减少, 肉芽组织逐渐被疤痕取代，左心室壁厚度明显变薄，且梗死面积变化较恒定。说明冠脉结扎45 min以上的大鼠心肌梗死病理变化过程更典型。本实验处理4周后评价冠脉不同结扎时间处理后心功能的变化发现：结扎（45 min或60 min）再灌或结扎非再灌各组ASP、ADP、LVSP、±dp/dtmax显著下降，LVEDP明显升高。同时，评价心肌梗死面积变化发现：结扎（45 min、60 min）再灌或结扎非再灌的大鼠左室心肌梗死面积及其占左室总面积百分比无差异。而且结扎30 min再灌组大鼠左室心肌梗死面积及其占左室总面积百分比低于结扎（45 min或60 min）再灌和结扎非再灌组，并且组内变异较大。这些与Himori的结果冠状动脉主干结扎30 min再灌4 h与结扎非再灌4 h的结果有差异[8]。其原因可能是结扎的部位不同、大鼠的侧枝循环很丰富所造成。可见，冠脉不同结扎时间处理后，心功能的变化与心肌梗死后的梗死面积变化密切相关，这与Pfeffer等的报道相似[9]。总之，我们复制的心肌梗死模型病理变化过程与实际心肌梗死发病过程基本一致，而且只要控制结扎部位在较稳定的左冠状动脉前降支中上1/3处，结扎时间在45 min以上，实验动物成活率高，复制的心肌梗死模型稳定，具有很好的可比性。

      [参  考  文  献]

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　 [2]     潘国栋，王凤捷，吴  艳,等.老年骨髓基质细胞移植治疗急性心肌梗死实验研究[J].郧阳医学院学报，2004,23（2）：65-67.    

　 [3]     杨建业，张迎春，唐俊明,等.阿霉素诱导大鼠心衰模型的建立[J].郧阳医学院学报，2005,24（5）：269-271.   

　 [4]     Dowell JD, Rubart M, Pasumarthi KB, et al. Myocyte and myogenic stem cell transplantation in the heart[J].Cardiovasc Res,2003,58(2):336-350.  

　  [5]      施新遒. 心血管疾病动物模型.医学实验动物学[M].北京:人民卫生出版社,2001:461-472.   

　  [6]     Geft IL, Fishbein MC, Ninomiya K, et al. Intermittent brief periods of ischemia have a cumulative effect and may cause myocardial necrosis[J].Circulation,1982,66(6):1 150-1 153.   

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　   [9]     Pfeffer MA, Pfeffer JM, Fishbein MC, et al. Myocardial infarct size and ventricular function in rats[J]. Circ Res,1979,44(4):503-512