HIF－1α反义寡核苷酸体外对人脑胶质瘤细胞U251的作用
作者：易显富, 杨贤义, 郭清浩, 康中山
[摘 要] 目的:研究缺氧诱导因子1α（HIF1α）反义寡核苷酸(ASODN)转染对人胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响,探讨以HIF1α为靶点进行反义寡核苷酸转染胶质瘤的有效性。方法:设计合成针对HIF1α的寡核苷酸片段.实验分6组：空白对照组、脂质体组、正义组和反义组（1.0 μmol/l、2.5 μmol/l和5.0 μmol/l）。利用脂质体包裹瞬时转染人胶质瘤细胞系U251,MTT法检测细胞增殖;采用AO/EB染色及末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡的变化。结果:转染后各组细胞增殖抑制率分别为（1.30±0.05）％、（1.98±0.35）％、（2.47±0.48）％、（22.30±2.08）％、（33.60±4.19）％和（56.20±4.22）％。转染HIF1α反义寡核苷酸组较各对照组相比细胞增生下降, 凋亡增加（P<0.01）。 结论:HIF1α反义寡核苷酸转染人胶质瘤U251细胞系可以抑制细胞增生并诱导胶质瘤细胞凋亡，HIF1α有望成为一个极具潜力的肿瘤治疗的靶点。[关键词] 反义寡核甘酸类，反义；缺氧诱导因子－1；胶质瘤
Abstract:Objective To investigate the effects of antisense oligodeoxynucleotides(ASODN) targeting HIF-1α on the apoptosis and proliferation of human glioma cell line U251 and to evaluate their efficacy as anticancer therapeutics. Methods ASODN targeting HIF-1α was designed and syntherized. Cultured U251 cells were devided into 6 groups:control group,lipsomes group,sense oligodeoxynucleotides(SODN) group,1.0 μmol/l ASODN group,2.5 μmol/l ASODN group and 5.0 μmol/l ASODN group. ODNs targeting HIF-1α transfected into U251 cells mediated by liposomal reagent. After transfected for 24 h , the cultured cells were harvested .Inhibitory rate(IR) by ASODN was determined by the colorimetri MTT cell viability;Apoptosis index (AI) and the apoptotic cell morphological changes were measured by acridine orange-ethidium bromide (AOEB) double fluorescent dye staining and TUNEL under fluorescence inverted microscopy. Results The IR in 6 group was （1.30±0.05）％,（1.98±0.35）％,（2.47±0.48）％,（22.30±2.08）％,（33.60±4.19）％,（56.20±4.22）％,respectively. The IR and AI rate in 3 ASODN groups was significantly higher than that in any other control groups（P<0.01）. Conclusion ASODN targeting HIF1α may induce U251 apoptosis and inhibit proliferation. HIF1α could be a promising anticancer target .
Key words:Oligodeoxynucleotide,Antisense;Hypoxia inducible factor 1α;Glioma
恶性肿瘤在生长过程中,组织增生过快必然会造成局部组织缺氧和供能与耗能之间的不平衡[1]。缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor 1α, HIF1）是调节肿瘤细胞对缺氧等微环境发生适应性反应的主要核转录因子,能通过诱导血管内皮生长因子(VEGF)和糖酵解相关酶的表达,增加供血、供氧、供能,改善这一失衡,与肿瘤的发生、密切相关[2]。HIF1α是决定HIF1活性的亚单位,在许多恶性肿瘤中的过表达与肿瘤的血管形成，侵袭转移，放化疗耐受等密切相关, 抑制肿瘤中HIF1α的表达则具有抗肿瘤效应。本实验利用反义寡核苷酸技术(antisenseoligodeoxynucleotides, ASODN)合成针对HIF1α的寡核苷酸片段,并利用阳离子脂质体包裹瞬时转染人胶质瘤细胞系U251, 观察其对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响，为以HIF1α为靶点的反义寡核苷酸治疗胶质瘤提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料人胶质瘤细胞系U251（中科院上海细胞生物化学研究所）。TUNEL试剂盒、阳离子脂质体Dosper(Roche公司)。SP试剂盒，鼠抗人HIF1α（福州迈新生物技术公司），细胞培养用1640（Gibco公司），胎牛血清（浙江杭州四季青公司），氯化钴(上海一新试剂公司)。吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)(Fluka公司)。
1.2 方法
1.2.1 HIF1α ODN的合成与修饰:HIF1α AsODN 5'GCCGGCGCCCTCCAT 3',并设置了HIF1α SODN作为对照, 5'ATGGAGGGCGCCGGC-3'。全部碱基进行硫代修饰，其中HIF1α AsODN 5'FAM荧光标记。
1.2.2 细胞培养与缺氧模型建立:人胶质瘤U251细胞系复苏后,加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。待细胞生长达对数生长期时，换以含终浓度为125 μmol/l氯化钴的1640培养液进行化学模拟缺氧, 置于细胞培养箱中继续培养备用。
1.2.3 实验分组与转染:细胞悬液直接种至6孔培养板内培养，转染时取对数生长期细胞，并融合50%~60%，每种处理有5孔。实验分六组：不同浓度反义寡核甘酸组（终浓度分别为1.0,2.5和5.0 μmol/l）、空白对照组、脂质体转染对照组和正义寡核甘酸转染对照组（终浓度为5.0 μmol/l）。按照Dosper转染试剂盒说明进行细胞转染。
1.2.4 反义寡核苷转染后荧光观察:转染15 min,6 h,24 h和48 h在荧光显微镜下进行观察、拍照，了解ODN在细胞内的代谢和稳定性，并初步判断转染效率。
1.2.5 MTT法检测胶质瘤细胞增殖活性:U251细胞经消化后计数, 以1.5×105个/ｍl接种96孔板,每孔200 μl,10%小牛血清1640培养基,5%CO2、37 ℃孵箱中培养12 h。培养细胞分组同前。按照脂质体试剂盒说明书进行脂质体包裹寡核苷酸片段及瞬时转染,分别在普通培养基培养24 h后在培养细胞中加入MTT (5 ｇ/l)50 μl/孔,继续孵育4 h,加入DMSO100 μl/孔,轻摇10 min后检测波长490 nm的吸光度(A)值，每组3孔。细胞生长抑制率[抑制率=(空白对照组平均A值-用药组平均A值)/空白对照组平均A值×100%]。
1.2.6 AO/EB双染法检测胶质瘤细胞凋亡:各组细胞转染后24 h分别消化离心收集弃上清,加入500 μl培养液,配成细胞悬液,再加入实验用AO/EB 溶液20 μl,混匀,置1滴于载玻片上,荧光显微镜下观察200个细胞,分别计数早期凋亡细胞(VA)、晚期凋亡(NVA)、活细胞(VN)及非凋亡的死亡细胞(NVN),计算凋亡率。凋亡率=(VA+NVA)/(VA+NVA+VN+NVN)×100%
1.2.7 TUNEL标记法:实验分组及转染同“1.2.3”所述。24 h后将各组玻片取出按照TUNEL试剂盒说明书进行染色。观察结果以所见细胞核有棕黄色颗粒者为阳性细胞,每个样品至少计数100个细胞中的阳性细胞数,重复计数3次,取平均值，作为细胞凋亡指数（Apoptotic index,AI）。
1.3 统计学方法
所有结果均以x±s表示,不同组别的比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 HIF1α AsODN后荧光显微镜下观察转染荧光标记的HIF1α ASODN后15 min ODN粘附于细胞膜表面，但胞核无荧光积聚。转染后6 h几乎所有细胞均出现核内均匀荧光积聚。此后核内荧光持续存在，至转染后24 h开始消退。48 h后,ODN仅偶见于个别细胞(见图1)。
2.2 MTT法检测胶质瘤细胞增殖活性
HIF1α ASODN转染对胶质瘤细胞有不同程度的抑制作用，且在一定的浓度范围内随着ASODN浓度的增加而增强，与各对照组相比均有显著性差异(P<0.01), 而SODN组、脂质体组与空白对照组间比较无显著性差异(P>0.05),见表1。
2.3 AO/EB双染法检测胶质瘤细胞凋亡AO/EB双荧光染色镜检可用于估计受检细胞群体中细胞凋亡的发生率。活细胞被AO染色发绿色荧光,细胞核呈现一至数个大小不等的圆珠状凋亡小体，边缘光滑、清晰,荧光亢进且均匀一致，符合细胞凋亡的核形态特征(见图2 )。细胞膜受损的晚期凋亡细胞则同时被EB 染色,核形态特征相同,但发橙红色荧光。非凋亡的死亡细胞,核染色质着橘红色并呈正常结构(见图2 )。不同浓度HIF1α ASODN作用后各组的细胞凋亡率见表1 ,在同一时间点各浓度组凋亡率与空白对照组相比均有显著差异(P<0.01);在同一时间点脂质体组、SODN组凋亡率与空白对照组相比无显著差异(P>0.05)。
2.4 TUNEL法检测胶质瘤细胞凋亡转染细胞培养后经末端标记法可观察到凋亡细胞胞核被染成棕黄色(见图3)。不同浓度的HIF1α ASODN均可诱导胶质瘤细胞凋亡，凋亡指数与各对照组相比均有增加（P<0.01），见表1。表1 HIF1α ODN转染对胶质瘤细胞增殖凋亡的影响(%, n=5, 略)注：与空白对照组相比较，*P>0.05；与各对照组相比较，▲P<0.01
3 讨论
反义寡核苷酸技术是根据碱基互补原则通过人工合成一段与靶基因及其mRNA互补的寡核苷酸片段,与相应靶基因或mRNA特异性结合,干扰基因的复制、转录和翻译过程,从而达到削弱或抑制该基因功能的目的[3]。利用反义寡核苷酸技术的这一特点,特异性抑制癌变中发挥重要作用的癌基因及生长因子等的表达,遏制细胞的恶性增生,诱导其凋亡从而达到肿瘤的目的。HIF1是肿瘤细胞在低氧环境下赖以生长的核转录因子，由α和β两亚单位组成异二聚体，HIF1α决定其活性，而HIF1β的功能则与维持其异二聚体结构有关。HIF1α在供氧正常时通过氧依赖性的泛素－蛋白酶体途径快速降解，而缺氧时HIF1α与肿瘤抑制蛋白pVHL结合降解受阻大量积聚。HIF1α与其下游靶基因启动子中一致性DNA序列结合，启动VEGF、IGF2、Glut和CA IX等与肿瘤血管生成、增殖、凋亡和能量代谢密切相关的靶基因转录。反义基因技术在肿瘤防治中的应用，最重要的一点是选择合适的靶基因。最理想的靶点是肿瘤细胞生长所必需而又不存在于正常细胞的细胞成分。Zhong H[4]等对脑肿瘤和正常脑组织研究发现，在癌组织中HIF1α过表达,且在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润的边缘, HIF1α表达明显增多,而正常脑组织则未见HIF1α表达。Sun 等[5~6]在动物实验中证实用瘤内注射反义HIF1α质粒能下调其靶基因VEGF表达,减少肿瘤微血管密度，完全抑制微小肿瘤生长，并能增强癌症免疫治疗的效力。联合应用反义HIF1α质粒和pVHL质粒效果更佳，肿瘤HIF1α、VEGF、微血管密度显著减少，凋亡增加。Zhang Q[7]等证实HIF1α反义基因治疗能显著抑制人舌鳞癌细胞增殖诱导其凋亡。氯化钴能在体外培养的细胞中产生类似缺氧状态，细胞对氯化钴刺激和缺氧刺激具有相同的氧感受、信号转导和转录调节机制，因此氯化钴模拟的体外实验与体内缺氧状态下的研究结果具有很强的可比性[8~9]。在本实验中我们用氯化钴复制胶质瘤细胞缺氧模型，诱导HIF1α表达，应用反义寡核苷酸技术合成特异性的寡核苷酸，以阳离子脂质体包裹转染人胶质瘤细胞系U251以抑制HIF1αmRNA和蛋白的表达，应用MTT法，AO/EB双染标记法和TUNEL等发现转染HIF1α反义寡核苷酸后胶质瘤细胞生长受到抑制，生长抑制率有显著性差异（P<0.01）。细胞凋亡是指在活组织中,由内在基因编码调控的程序性细胞死亡过程,是机体一种正常生理现象。细胞的凋亡决定细胞的死亡, 肿瘤细胞凋亡说明机体可通过自主地清除恶变的或可能恶变的细胞来对抗肿瘤的发生和。细胞凋亡常参与多种疾病的发生与发展, 研究细胞凋亡对评估肿瘤预后有一定意义。AO/EB染色法则可以半定量检测凋亡, 它不但可以检测细胞的凋亡率, 而且还能了解膜受损细胞率, 是研究细胞凋亡的重要检测方法。TUNEL方法是一种将细胞凋亡形态学观察与分子生物学检测相结合的有效而敏感的凋亡原位定量研究的方法。本实验中将两种方法结合应用，研究发现HIF1α反义寡核苷酸转染使胶质瘤细胞凋亡率显著增加。细胞增生和凋亡失衡与肿瘤的发生发展密切相关,并直接关系到肿瘤患者的愈后。本研究应用反义HIF1α寡核苷酸转染人胶质瘤细胞可以抑制肿瘤细胞的增生并诱导细胞凋亡,为进一步进行以HIF1α为靶点的抗肿瘤治疗研究提供了一定的实验依据。（文中图1~3见封三）
[参 考 文 献]
[1] Harris AL.Hypoxia-a key regulatory factor in tumour growth[J].Nat Rev Cancer,2002,2(1):38－47.
[2] Richard DE, Berra E, Pouyssegur J. Angiogenesis: how a tumor adapts to hypoxia[J]. Biochem Biophys Res Commun,1999,266(3):718-722.
[3] Stein CA,Cheng YC.Antisense oligonucleotides as therapeutic agents-is the bullet really magical?[J]. Science,1993,261(5 124):1 004-1 012.
[4] Zhong H,De Marzo AM,Laughner E,et al.Overexpression of hypoxia-inducible factor 1alpha in common human cancers and their metastases[J].Cancer Res,1999,59(22):5 830-5 835.
[5] Sun X, Kanwar JR, Leung E, et al.Gene transfer of antisense hypoxia inducible factor-1 alpha enhances the therapeutic efficacy of cancer immunotherapy[J]. Gene Ther,2001,8(8):638-645.
[6] Sun X,Kanwar JR,Leung E，et al. Regression of solid tumors by engineered overexpression of von Hippel-Lindau tumor suppressor protein and antisense hypoxia-inducible factor-1alpha[J].Gene Ther,2003,10(25):2 081-2 089.
[7] Zhang Q, Zhang ZF, Rao JY, et al.Treatment with siRNA and antisense oligonucleotides targeted to HIF-1alpha induced apoptosis in human tongue squamous cell carcinomas[J].Int J Cancer,2004,111(6):849-857.
[8] Liu X, Kirschenbaum A, Yao S,et al.Upregulation of vascular endothelial growth factor by cobalt chloride-simulated hypoxia is mediated by persistent induction of cyclooxygenase-2 in a metastatic human prostate cancer cell line[J].Clin Exp Metastasis,1999,17(8):687-694.
[9] Bunn HF,Poyton RO.Oxygen sensing and molecular adaptation to hypoxia[J].Physiol Rev,1996,76(3):839-885.
