复方参七汤对人结肠癌细胞株裸鼠肝转移影响
作者：陈瑞新,徐青,于秀,陈玉泉,沈洪薰
[摘要] 目的:建立人结肠癌细胞株裸鼠肝转移模型，研究复方参七汤对裸鼠肝转移模型的影响。方法:采用BALB/C裸鼠，Ls174t人大肠癌细胞株, 脾脏切除脾脏种植法建立裸鼠肝转移模型。给予复方参七汤颗粒饲料喂养，观察体态及肿瘤生长情况；采用巢式逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测裸鼠循环血中CK20 mRNA表达；标本作病理组织学检查。结果:①脾脏切除脾脏种植法建立裸鼠结肠癌肝转移模型的成功率为100%，病理组织学证实肝转移癌细胞呈人结肠癌低分化腺癌特征；②实验组裸鼠肿瘤数目及重量明显低于对照组，P<0.05；③实验组裸鼠肝转移血中CK20 mRNA表达为0.398±0.143,明显低于对照组0.518±0.090，P<0.05。结论:复方参七汤可显著降低肝转移裸鼠血中CK20 mRNA表达，抑制裸鼠结肠癌肝转移的发生及，可作为大肠癌术后预防复发和肝转移的手段之一。
[关键词] 结肠癌;肝转移;裸鼠;CK20 mRNA;RT-PCR
Abstract: Objective To establish the liver metastases of colonic adenocarcinoma for experimental study of the effect of compound shenqitang in nude mice.Methods Nude mice liver metastasis model of colonic cancer was established with human colonic cancer cells line (Ls 174t) inoculated into mice spleen.Granular forage with compound shenqitang was fed in experimental group and granular forage without compound shenqitang was fed in control group daily. The weight and size of the mice and growth of the carcinoma were recorded.All specimens were examined histologically.CK20 mRNA in blood in nude mice with liver metastasis of colonic carcinoma was detected with nested RT-PCR. Results The incidence of liver metastasis was 100 % in this intrasplenic injection model. The pathological results showed that tumour cells of liver metastases was poorly differentiated human colonic adenocarcinoma.In experimental group, the tumor number and the weight of liver metastases were significantly lower than those in control group(P<0.05).Using semiquantitative examination,in experimental group the relative value of CK 20 mRNA expression in blood (0.40±0.14) was significantly lower than that(0.52±0.09) in control group (P<0.05).Conclusion Compound shenqitang could effectively inhibit the occurrence of liver metastasis carcinoma and decrease the positive expression of CK20 mRNA in experimental group,suggesting that compound shenqitang may become the potential therapeutic strategy for liver metatstasis of colonic cancer.
Keywords:Colonic carcinoma；Liver metastases；Nude mice；CK20 mRNA；RT-PCR
大肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，目前仍以手术切除为首选方法，但由于术后局部复发和转移，其整体治疗水平仍不尽人意，术后5年生存率仍在50%~55%之间[1-2]。近年来，通过西医和中医药的综合治疗，患者的生存率有了明显提高[3]。本实验通过建立裸鼠肝转移模型，应用CK20 mRNA表达等观察指标，研究中药复方参七汤对裸鼠结肠癌肝转移的防治作用，以期为临床应用提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 中药复方参七汤沈洪薰教授的经验方[4-5]。由参三七、人参、黄芪、当归、陈皮、木香、川草乌、半枝莲、半边莲、甘草、谷麦芽等组成。每帖中药煎成200 ml，配制颗粒饲料。
1.2 Ls 174t细胞悬液的制备人结肠腺癌Ls 174t细胞株购于中科院上海细胞库。采用RPMI-1640完全培养基，置于37 ℃含5%CO2培养箱内，取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)消化，制成细胞悬液0.1 ml,含细胞数1×106个，台盼蓝测定细胞活力在95%以上。
1.3 实验模型制备24 只(4～6周龄)裸小鼠购于中科院上海实验动物中心，随机分为实验组和对照组（各12只）。经腹腔注射1%戊巴比妥钠0.15ml～0.2 ml (40 mg・kg-1)麻醉，左肋缘下0.5 cm处打开腹腔，用4号针将0.1 ml细胞悬液缓慢注入脾脏下极的包膜下，注射点用75%酒精棉球压迫出血点，5 min后将脾脏切除，腹壁全层缝合，置于SPF动物房中喂养。实验组每天喂以复方参七汤颗粒饲料（0.6 ml/20g体重),对照组裸鼠喂以普通颗粒饲料。
1.4 观察指标
1.4.1 大体观察:密切观察裸鼠的生长变化，每天记录裸鼠体重、摄食量及活动。喂养3周后处死，检查肝转移癌结节数目，挖出并称重。肝脏标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察癌组织形态。
1.4.2 CK20 mRNA检测:裸鼠处死前心脏采血，另取10 只正常裸鼠血标本作正常对照，分别置于肝素抗凝管内，混匀。单核细胞制备采用密度梯度离心法，总RNA提取采用Trizol抽提法。应用Gibco公司生产的逆转录试剂盒合成cDNA，具体操作步骤按制造商提供方法进行。引物合成：按报道方法合成CK20引物A,B,C,D和β-actin引物1、2。
Ck 20A:5`-CAGACACACGGTGAACTATGG-3`
B:5`-GATCAGCTTCCACTGTTAGACG-3`
C:5`-GGTTTGTTGGCAATGAGAAAATGG-3`
D:5`-GTATTCCTCTCTCAGTCTCATACT-3`
β-actin1:5`-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3`
2:5`-GTTTTCTGCGCAAGGTTAGG-3`
巢式PCR： 循环条件为95 ℃ 10 s,63 ℃ 20 s,72 ℃ 10 s共35个周期。2 次PCR扩增，除引物和模板外，其余均相同。第1次PCR扩增，加cDNA 8 μl，取引物 A和引物B，反应总体积为50 μl，扩增产物为370 bp。第2次PCR扩增，加第1次扩增产物1 μl，取引物C和引物 D，反应总体积为50 μl，扩增产物为303 bp。内参β-actin，循环条件为95 ℃1 s,60 ℃ 1 s,72 ℃ 1 s共35个周期，cDNA 4 μl，反应总体积为50 μl，扩增产物为531 bp。从PC基因软件包中寻求对两轮PCR产物仅有一个酶切位点的核酸内切酶Csp6Ⅰ，对扩增产物进行酶切。20%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色。用CK20与β-actin电泳条带的光密度比值出CK20 mRNA表达的相对量。
1.7 统计方法t检验或确切概率法，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况接种初期,两组裸鼠均活跃如常，体形无改变；2周后, 实验组裸鼠大部分生长良好，未发现恶液质；而对照组裸鼠大部分出现消瘦，精神差，摄食减少。实验组裸鼠前后体重增长值显著高于对照组（P<0.050);两组裸鼠肝表面均发现0.2～0.7 cm的灰白色肝转移癌结节，肝转移率均为100%。但实验组转移数目明显少于对照组，且癌结节重量也明显低于对照组（P<0.05）；其癌重/肝重比值亦明显小于对照组(P<0.05)，结果见表1。
2.2 病理组织学改变两组均呈人结肠癌低分化腺癌表现。实验组肝转移癌组织有凝固性坏死，组织结构不清，伴有炎细胞浸润，部分癌结节边缘存留少量癌组织，小片状癌巢等(见图1)。对照组的肝转移癌细胞呈团块状分布，细胞体积较大，核大不规则，核仁明显，间有小腔样结构，癌组织无坏死性改变（见图2）。
表1 复方参七汤对裸鼠接种人结肠癌细胞肝转移模型的影响（略）
注：与对照组相比,*P<0.05
2.3 CK20 mRNA的阳性表达两组裸鼠血中CK20 mRNA阳性表达率均为100%(12/12)。实验组CK 20 mRNA相对值为040±0.14，明显低于对照组0.52±0.09，P<005，（见表1、图3）。
图3 各组裸鼠血CK20 mRNA在2%琼脂糖凝胶电泳的结果（略）
M：标准品； 1、2：正常裸鼠；3、4：实验组裸鼠；5、6、7：对照组裸鼠
3 讨论
裸鼠体内肝转移模型建立的主要方法有盲肠壁种植法和脾脏切除脾脏种植法。本实验采用目前较为公认的脾脏切除脾脏种植法，该法运用单细胞悬液注入脾脏，再由脾脏经血流进入肝脏，由于脾脏本身是一个免疫器官，癌细胞必须逃脱淋巴细胞、巨噬细胞等的攻击才能到达肝脏形成转移[6,7]，因此采用这一方法造模，能很大程度上接近临床病人结肠癌肝转移的过程。本研究成功地建立人结肠癌细胞株裸鼠肝转移模型，肝转移率达100%，病理组织学显示，裸鼠肝转移癌灶呈人结肠癌低分化腺癌表现。CK20具有严格的上皮组织特异性，在癌细胞发生、生化、衰变、肿瘤转移、体外培养等改变下均呈阳性表达[11]，故许多学者将CK20 mRNA用于人大肠癌、胃癌、膀胱癌患者循环血中肿瘤细胞的标志物[12-14]。本实验建立的裸鼠肝转移模型，人结肠癌细胞在裸鼠肝转移过程中并不改变原有生物学特性，即裸鼠肝转移模型循环血中CK20 mRNA表达阳性，表明CK20 mRNA表达可作为检测肝转移模型成功的指标之一目前大肠癌的仍以外科手术为首选方法，通过手术切除肿瘤病灶，达到根治目的，但对于微小的转移灶则无能为力。中医认为，结肠癌是由机体正气不足、湿毒瘀滞凝结而致病，术后可致气虚血瘀。中医通过调整机体，平衡阴阳，提高机体免疫功能，清除微小的转移灶，抑制肿瘤的转移和复发。复方参七汤是由参三七、人参、黄芪、当归、陈皮、木香、川草乌、半枝莲、半边莲、甘草、谷麦芽等组成。治以健脾益气、清热祛湿、活血化瘀。目前的药研究表明，其中的大多数药物具有明确的抗肿瘤及其转移作用。参三七主要化学成分三七皂有抗肿瘤活性[8]，与人参同用可止血散瘀、补气养血，活血消积。黄芪提取物具有调节免疫活性，促进外周血单核细胞对肿瘤细胞的吞噬和产生细胞因子的作用[9]；制川乌、川草乌具有祛风除湿，温经止痛功效及抗肿瘤作用[10]。半枝莲、半边莲具有清热解毒、散瘀止血、定痛功效。以上各种药物的抗肿瘤作用都可能是复方参七汤药理作用的物质基础。本实验结果中尽管实验组裸鼠癌重、转移数目、病理改变、循环血中CK20 mRNA含量等指标均低于对照组，但裸鼠模型肝转移率为100%也表明，复方参七汤虽有增强机体抵抗力、抑制肿瘤生长的作用，但并不能完全抑制肿瘤的复发和转移，必须配合其它方法，才能彻底抑制肿瘤的复发和转移。中医中药治疗作为结肠癌综合治疗的一部分，通过平衡阴阳，提高机体免疫功能、杀灭肿瘤细胞等方法，对防治肿瘤的转移和复发有十分重要的意义。本实验采用的复方参七汤系经验方，符合中医中药的传统习惯，当然本实验仅以中药复方参七汤来研究大肠癌的复发和转移，可能有一定的局限性。手术根治、化疗、放疗和中医药等综合治疗，应是进一步提高结肠癌患者生存率的理想途径[15]。
(文中图1~2见封三)（略）
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