凝血酶预处理对海马神经元的保护作用
作者：杨文琼,孙圣刚,童萼塘
[摘要] 目的:研究凝血酶预处理（TPC）对大剂量凝血酶（TM）诱导海马神经元凋亡的影响，阐明TPC的保护作用。方法:海马神经元分别经生理盐水（Sham组）、小剂量TM（TPC组）及凝血酶受体激活肽（TRAP组）预处理48 h后再加大剂量TM作用24 h。TUNEL法及流式细胞术检测凋亡细胞数和凋亡百分率，应用免疫细胞化学方法检测神经元Bcl-2及Bax蛋白表达。结果:与Sham组比较，TPC组TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率明显降低（P<0.01），Bcl-2表达上调，Bax表达明显下调（P<0.01）。与Sham组比较，TRAP预处理组TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率明显降低（P<0.01），Bcl-2表达上调，Bax表达明显下调（P<0.01）。TRAP预处理组与TPC组相比差异无显著性（P>0.05）。结论:TPC可抑制TM导致的神经细胞凋亡，激活PAR-1，促进Bcl-2的表达和降低Bax的表达，可能是TPC抑制细胞凋亡的机制之一。
[关键词] 凝血酶预处理；细胞凋亡；Bcl-2；Bax；蛋白酶激活受体-1
The Effect of Thrombin Preconditioning on the Apoptosis of Hippocampal Neurons
Abstract:Objective To investigate the effect of thrombin preconditioning（TPC）on the apoptosis of hippocampal neurons and explore the potential mechanisms. Methods Hippocampal neurons were pretreated with saline,1U/ml TM and 5μmol/L thrombin receptor activating peptides（TRAP）for 48h before exposed to 40U/ml TM,respectively.The number of apoptotic cells and apoptotic rate of neurons were measured by terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) mediated dUTP-biotin nick end-labeling（TUNEL）method and Flow cytometry.Bcl-2 and Bax protein expression were measured by immuocytochemical method.Results The number of apoptotic cells and apoptotic rate of neurons were decreased significantly in TPC group（P<0.01）.Bcl-2 protein expression was increased, Bax protein expression was decreased significantly in TPC group（P<0.01）.Compared to Sham group,the number of apoptotic cells and apoptotic rate of neurons were decreased significantly in TRAP group（P<0.01）.Bcl-2 protein expression was increased,Bax protein expression was decreased significantly in TRAP group（P<0.01）.There was no significant difference in TRAP group and TPC group（P>0.05）.Conclusion TPC could inhibit neuron apoptosis induced by TM.The mechanism of neuroprotective effect of TPC may be through activating PAR-1,up-regulating Bcl-2 protein expression and down-regulating Bax expression.
Key words:Thrombin preconditioning;Apoptosis;Bcl-2;Bax;Protease activated receptor-1
作为血肿成分中最特殊的物质，凝血酶在脑出血脑损伤中的作用倍受关注[1]。研究发现，虽然大剂量凝血酶可导致脑损伤和细胞凋亡，但低浓度的凝血酶却具有神经保护作用。经过小剂量凝血酶预处理后，凝血酶和脑内血肿所致的脑水肿可减轻，大鼠大脑中动脉梗塞模型中的梗塞面积明显减小[2,3]，这种现象被称为凝血酶预处理（Thrombin Preconditioning,TPC）或凝血酶诱导的脑耐受。为了探讨凝血酶预处理的神经保护机理，本实验采用小剂量凝血酶预处理原代培养的海马神经元，结合TUNEL法、流式细胞术及免疫细胞化学等方法，研究凝血酶预处理的保护作用及其机制。
1 材料和方法
1.1 材料新生SD大鼠80只(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供),凝血酶（Sigma公司）,凝血酶受体激活肽（TRAP，武汉协和心血管研究所合成），DMEM培养基,B27促生长剂（Gibco），神经元特异性烯醇化酶（NSE），Bcl-2、Bax小鼠单克隆抗体（Santa Cruz）,TUNEL试剂盒（Roche公司）,SP免疫组织化学试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 新生大鼠海马神经元原代培养:取1 d新生SD大鼠速冻3~5 min,消毒后于超净工作台内,开颅取全脑,立即置于冰冷的无菌解剖液中,分离海马,切碎,置终浓度0.125%胰酶,37 ℃, 5%CO2培养箱内消化30 min。适量完全培养基（DMEM+10%胎牛血清+10%马血清）终止消化,过滤，离心后沉淀用完全培养基稀释，悬浮细胞用沙利白细胞计数板计数。以1×106~1×107/ml密度分别接种于经多聚赖氨酸处理的24 孔板和6 孔板培养板中,在完全培养基中于37 ℃，5%CO2培养箱内培养。24 h后全量换B27培养基(DMEM基础培养基+2%B27)进行无血清培养。以后每3天换半量培养液,取7~9 d的细胞用于实验。用本方法培养的细胞经NSE免疫细胞化学方法鉴定，NSE阳性细胞达95%以上。
1.2.2 实验分组:将培养的海马神经细胞分为：①生理盐水预处理（Sham）组：即在细胞培养液中先加入生理盐水，在37 ℃，5%CO2条件下培养48 h后再加40 U/ml凝血酶；②凝血酶预处理（TPC）组：即在细胞培养液中先加入1 U/ml凝血酶，在37 ℃，5%CO2条件下培养48 h后再加40 U/ml凝血酶；③凝血酶受体激活肽（TRAP）组：即在细胞培养液中先加入5 μmol/L TRAP，在37 ℃，5%CO2条件下培养48 h后再加40 U/ml凝血酶，以上各组细胞继续培养24 h后，分别进行以下的实验观察和检测。每组做4个样本，分别来自4批独立培养的细胞。
1.2.3 TUNEL法检测凋亡细胞数:细胞爬片经4%多聚甲醛固定30 min,按试剂盒说明书,分别经穿透、加TUNEL反应混合液、抗地高辛抗体反应、NBT/BCIP显色、脱水、透明、封片、显微镜下观察。计数10个高倍视野(20×10)内的凋亡细胞数。
1.2.4 流式细胞仪检测凋亡率:将培养细胞用025%胰酶消化3～7 min,1 000～1 500 r/min离心5 min,去上清液,用振荡器使细胞分散。每个样品收集2×106细胞。70%冷乙醇固定细胞,置4 ℃保存。测试前离心,去固定液,用PBS洗2次。加RNA酶100 μl(50 μg/ml)37 ℃恒温水浴消化30 min,再加1 mlPI染液(50 μg/ml)4 ℃避光30 min后上机测定。观察是否在G1峰前出现凋亡特有的AP峰,该细胞占总细胞的百分数,即凋亡百分数。
1.2.5 免疫细胞化学染色:将长有细胞的盖玻片用0.01 mol/L PBS浸洗,4%多聚甲醛固定30 min,依次入含0.3%H2O2的甲醇溶液、0.3%TritonX-100的PBS液、1∶50的正常血清封闭,37 ℃各孵育30 min。分别加入Bcl-2，Bax小鼠单克隆抗体（1∶100），37 ℃孵育2 h;PBS洗3次,生物素化抗小鼠IgG(二抗)37 ℃孵育1 h;PBS洗3次;SABC，37 ℃孵育1 h;PBS洗3次，DAB显色5~15 min，蒸馏水洗涤，苏木素复染1~5 min，常规脱水，透明，封片。所有阴性对照片均以PBS代替一抗工作液。显微镜下观察海马神经元，以胞浆或胞核出现棕黄色颗粒为阳性信号。每个样品随机数500个细胞，计数含阳性颗粒的细胞数，阳性细胞百分数。
1.2.6 图象分析:随机采集200个阳性细胞，HIPAS-1000全自动医学彩色图像分析系统进行图像分析，检测阳性细胞内表达产物的平均光密度值（OD），对Bcl-2、Bax表达产物进行半定量。
1.3 统计学处理采用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，包括方差分析、t检验等，结果以均数±标准差(x±s)表示， 以P<0.05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 TUNEL染色结果Sham组可见较多凋亡细胞（27.3%），TPC组（4%）与TRAP组（4.5%）凋亡阳性细胞数明显减少。
2.2 细胞凋亡率流式细胞仪检测观察亚G1峰即特征性凋亡峰的出现，计算该细胞占总细胞的百分数，即凋亡百分率。Sham组中凋亡百分率较高（29.30%），明显高于TPC组与TRAP组（4.5%，5.59%，P<0.01）。TRAP组凋亡百分率与TPC组相比差异无显著性（P>0.05）。
2.3 TPC对神经元Bcl-2及Bax蛋白表达的影响Sham组Bcl-2表达较少，TPC组明显升高，与Sham组相比存在显著差异（P<0.01）。TRAP组Bcl-2亦上升，与TPC组相比差异无显著性（P>0.05），见表1。
Sham组有大量Bax阳性表达。TPC组Bax蛋白表达与Sham组相比明显降低（P<0.01）。TRAP组与TPC组相比差异无显著性（P>0.05），见表1。
表1 TPC对海马神经元Bcl-2及Bax蛋白表达的影响（略）
注：与Sham组比较，*P<0.01
3 讨论
凝血酶是丝氨酸蛋白酶家族中最重要的成员之一，由无活性的凝血酶原产生。1 ml的全血可产生约1~2 nmol的凝血酶[4]。脑损害如脑出血和脑损伤导致血液进入脑实质，凝血酶原裂解立即产生大量的凝血酶。在头部穿透伤、出血性中风、脑血管瘤、动静脉畸形破裂等脑血管疾病发生中，血液中的凝血酶可直接进入脑组织，凝血酶亦可能在中风和神经外科手术时进入脑组织[5]。凝血酶与神经细胞接触后将激发一系列的病理生理反应，大剂量凝血酶会对神经细胞产生毒性作用。资料显示，小剂量的凝血酶可保护神经元免于缺氧和β-myloid所致的毒性损害[6-8]。Masada[3]等在大鼠大脑中动脉闭塞模型中发现，TPC组在皮质区，基底节区脑水肿明显减轻，梗死体积明显缩小，神经缺损严重程度明显减轻，水蛭素可抑制上述作用。因此，凝血酶预处理保护作用机制的探讨可为脑出血的临床治疗提供新的研究方向。我们前述研究显示大剂量凝血酶可导致海马神经元发生凋亡[9-10]，用1 U/ml凝血酶预处理后再加入大剂量凝血酶，TUNEL和流式细胞术检测发现TPC组凋亡细胞数和凋亡百分率较Sham组明显减少，提示凝血酶预处理可减轻大剂量凝血酶所致的细胞凋亡。Bcl-2和Bax都是与凋亡密切相关的基因，它们的作用是相互拮抗的，Bcl-2能抑制细胞凋亡，而Bax则介导细胞凋亡。二者之比决定细胞对各种引起细胞凋亡刺激的敏感性，影响着细胞的生存和死亡[11]。凝血酶预处理的抗细胞凋亡的机制目前尚未清楚。本实验用免疫细胞化学检测Bcl-2及Bax的表达，发现生理盐水预处理组Bcl-2蛋白的表达较低，TPC组Bcl-2的表达与Sham组比较明显增加，说明TPC可上调Bcl-2的表达。而TPC组Bax的表达较Sham组明显减少，提示TPC可抑制Bax的表达，对抗凝血酶的作用。凝血酶通过激活PAR-1受体，参与一系列的病理生理过程。PAR-1受体激活后产生跨膜信号转导，引起细胞内Ca2+离子的移动和蛋白磷酸化，产生一系列效应[12]。本实验用5 μmol/L的凝血酶受体激活肽预处理海马神经元，同样可以减轻大剂量凝血酶引起神经元凋亡的作用，并且凋亡调控因子的变化与TPC相似，即可促进Bcl-2表达及抑制Bax的表达,提示凝血酶预处理过程中有凝血酶受体的激活。综上所述，本实验显示凝血酶预处理可以抑制凝血酶诱导的细胞凋亡，其可能机制是激活PAR-1，上调Bcl-2的表达及下调Bax的表达，从而抑制细胞凋亡。进一步深入研究凝血酶预处理中各种信号转导及因子的相互关系，阐明凝血酶预处理的保护作用机制，可能对脑出血的防治提供新的启示。
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