缺氧诱导因子_1α及碱性成纤维细胞生长因子在人乳腺癌组织中的表达及其与血管生成的关系

【摘要】  目的：探讨缺氧诱导因子_1α(HIF_1α)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在人乳腺癌组织中的表达，以及两者与乳腺癌血管生成的关系及作用机制。方法：用免疫组化检测67例乳腺癌及39例乳腺纤维腺瘤组织中HIF_1α和bFGF的表达；用CD105标记血管内皮细胞并计数肿瘤微血管密度(MVD)。结果：HIF_1α及bFGF在乳腺癌组织中的表达阳性率分别为80?6%(54/67)、73?1%(49/67)，与乳腺纤维腺瘤组织中的表达阳性率［0?0%(0/39)、35?9%(14/39)］比有统计学意义(P<0?001)；乳腺癌组织中HIF_1α与bFGF的表达呈正相关(rs=0?314，P<0?01)；乳腺癌淋巴结转移阳性组中HIF_1α及bFGF的表达与阴性组比无统计学意义；HIF_1α及bFGF阳性肿瘤组织中的MVD均值显著高于阴性组织，且MVD随着HIF_1α及bFGF表达的增强而增加；淋巴结转移阳性组中MVD高于阴性组(P<0?05)。结论：HIF_1α和bFGF在人乳腺癌组织中均高表达，且两者具有明显的相关性；HIF_1α与bFGF间可能通过相互作用共同调节乳腺癌血管生成。

【关键词】  乳腺癌 缺氧诱导因子_1α 碱性成纤维细胞生长因子 微血管密度

    ［Abstract］Objective: To investigate the expression of hypoxia_inducible factor 1 alpha(HIF_1α)and basic fibroblast growth factor(bFGF)in human breast cancer and their relationship with tumor angiogenesis. Methods: The expression of HIF_1α and bFGF was examined in 67 cases of breast cancer specimens, 39 cases of fibroadenoma of breast by immunohistochemical method and the microvascular density(MVD)was counted in specimens marked by CD105 in the vascular endothelial cells. Results: The expression of HIF_1α and bFGF was statistically significant between fibroadenoma of breast and breast cancer respectively(P<0?001). The expression of HIF_1α was significantly correlated with bFGF in breast cancer(rs=0?314，P<0?01). The expressions of HIF_1α and bFGF were no statistical significance in the positive and negative lymph node metastasis groups respectively. The MVD value in the cancer tissue of positive expression of HIF_1α and bFGF was significantly higher than in the negative expression, and the number of the MVD increased along with the high expression of HIF_1α and bFGF in cancer tissues. The value of MVD in the positive lymph node metastasis group was higher than in the negative group(P<0?05). Conclusion: There is obviously positive correlation between the expressions of HIF_1α and bFGF in breast cancer. The interaction of HIF_1α and bFGF may play an important role in the regulation of angiogenesis of breast cancer.

    ［Key Words］breast cancer; hypoxia_inducible factor 1 alpha; basic fibroblast growth factor; microvascular density

    缺氧是乳腺癌过程中的普遍现象，新生血管的形成是乳腺癌解决缺氧的重要途径。新生血管在乳腺癌细胞增殖、早期发生血行转移及微转移灶发展过程中具有重要作用［1］。缺氧诱导因子_1α(HIF_1α)是介导细胞对缺氧微环境进行适应性反应的关键性转录调控基因，HIF_1α通过调节缺氧诱导的相关基因表达，促进组织的能量代谢、血管生成等。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种多效促有丝分裂原，能促进多种细胞和组织生长、分化［2］。研究发现，HIF_1α、bFGF在乳腺癌的发生发展、浸润和转移过程中起重要作用［3，4］，但关于乳腺癌组织HIF_1α、bFGF表达的相关性及共同促进新生血管生成的机制国内、外尚未见报道。本研究收集2005_01～2006_12我科手术切除的乳腺癌组织石蜡标本67份(例)，并用免疫组化检测乳腺癌组织HIF_1α、bFGF的表达，用CD105标记血管内皮细胞并计数肿瘤微血管密度(MVD)，旨在探讨HIF_1α、bFGF在乳腺癌组织中表达的相关性，及两者在促进乳腺癌血管生成中的作用。

    1资料与方法

    1?1分组乳腺癌组［67例。年龄24～76岁，平均(49?7±9?1)岁］均经病理确诊，术前均未接受放、化疗，淋巴结转移31例，无转移36例。乳腺纤维腺瘤组(39例)年龄18～46岁，平均(32?6±7?8)岁。

    1?2试剂

    鼠抗人HIF_1α单克隆抗体(Neomarker公司，美国)，兔抗bFGF多克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)，鼠抗人CD105单克隆抗体、PV_9000试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

    1?3免疫组化染色

    免疫组化EnVision二步法：乳腺癌组织石蜡切片经常规脱蜡至水，体积分数3%的H2O2封闭10?min以灭活内源性过氧化物酶，经微波修复抗原后，分别加入bFGF(1∶200)、HIF_1(1∶40)、CD105(1∶100)并湿盒孵育。再先、后加PV_9000试剂盒中的试剂1、2，DAB显色剂显色，苏木精对比染色。根据试剂说明书，用已知结肠癌阳性片作对照，用PBS代替1抗作阴性对照。

    1?4结果判定?①HIF_1α、bFGF染色结果判断标准：以细胞浆或细胞核中表达棕黄色颗粒为阳性，在低倍镜(100×)下选染色均匀区，再在高倍镜(400×)下对每张切片随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，共计1?000个。每张切片阳性细胞百分率，切片中阳性细胞数：<5%为阴性片，5%～25%为阳性(+)，>25%～50%为中度阳性(++)，>50%为强阳性(+++)。②CD105阳性微血管的判断标准与MVD计数方法见［5］。

    1?5统计学处理

    采用SPSS10?0软件系统，计数资料采用χ2检验，两组计量资料用t检验，相关分析采用Spearman等级相关分析法。

    2结果

    2?1HIF_1α、bFGF和CD105的表达及与淋巴结转移的关系

    HIF_1α主要在乳腺癌细胞的胞浆和胞核中表达(图2，封3)，而在乳腺纤维腺瘤组织中基本不表达(P<0?001，表1)。bFGF主要在乳腺癌细胞的胞浆中表达，少数在细胞核中也有表达，而乳腺纤维腺瘤组织中主要在乳腺导管上皮的基底细胞核中表达(图1、4，封3），乳腺癌组bFGF的阳性率明显高于乳腺纤维腺瘤组(P<0?001，表1)。CD105主要在微血管内皮细胞中表达，乳腺癌组织中CD105阳性微血管主要集中在癌巢周围的间质中，部分在癌巢中央可见，形态可呈单个内皮细胞，不规则条索状结构，且见部分血管管腔结构(图3，封3)。乳腺癌组CD105阳性MVD明显高于乳腺纤维腺瘤组(P<0?001，表2)。乳腺癌淋巴结阳性组中HIF_1α、bFGF的阳性率分别与阴性组比无统计学意义(表1)；乳腺癌淋巴结阳性组中MVD值明显高于阴性组(P<0?05，表2)。表1乳腺癌和乳腺纤维腺瘤组织中HIF_1α、bFGF的表达及与淋巴结转移的关系 表2乳腺癌和乳腺纤维腺瘤组织中CD105表达和MVD值

    2?2相关性分析?①乳腺癌组织中HIF_1α阴性组MVD与阳性组比有统计学意义(P<0?01)。随着HIF_1α表达增强，MVD增加(r=0?30，P<0?05)。②乳腺癌组织中bFGF阴性组MVD与bFGF阳性组比有统计学意义(P<0?001)，随着bFGF表达增强，MVD增加(r=0?36，P<0?05)。③bFGF阳性组的HIF_1α阳性表达率为85?7%(42/49)，阴性组66?7%(12/18)，Spearman等级相关分析表明二者呈正相关(rs=0?314，P<0?05)，即随着bFGF的表达上调，HIF_1α的表达也有升高(表3)。表3乳腺癌组织内HIF_1α与bFGF的表达相关性

    3讨论

    HIF_1由α和β亚基构成，其中α亚基是唯一的氧调节亚单位，决定HIF_1活性。HIF_1α通过与血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生长因子等缺氧反应基因的启动子或增强子上的结合位点结合而促进后者表达，从而产生一系列生物学效应［6］。研究证实，HIF_1α在大多数肿瘤组织中高表达［7］，在氧平衡及肿瘤微血管形成中起重要作用。将HIF_1α缺陷的肿瘤细胞异种移植，发现所生成的肿瘤中血管密度明显降低［8］。本研究结果显示，乳腺癌组织中HIF_1α阳性率为80?6%，但在乳腺纤维腺瘤组织中则基本不表达，癌组织中HIF_1α过表达与肿瘤MVD密切相关，提示HIF_1α与乳腺癌的发生、密切相关，且在乳腺癌的血管形成中起重要作用。

    研究发现，乳腺癌组织过表达bFGF及其受体，直接作用于各种细胞而引起细胞转化，最终形成肿瘤［3］，且细胞内bFGF表达强度与乳腺癌细胞的迁移扩散及恶化程度呈正相关［9］。bFGF被证实是最有效的促血管生成因子之一，与其它生长因子共同作用下发挥较大的促血管生成活性。FGF_结合蛋白(FGF_BP)是已知的肿瘤相关血管生成的重要限速因子，是人体各类肿瘤血管生成的总开关。bFGF可能通过激活p38和MEK1/ERK信号通路来调节FGF_BP分泌，促进乳腺癌血管生成［10］。本研究结果显示：乳腺癌组织中bFGF的阳性率为73?1%，乳腺纤维腺瘤组织35?9%(P<0?001)；bFGF过表达与肿瘤MVD密切相关，与乳腺癌血管生成有密切关系；bFGF在乳腺癌淋巴结转移阴性组及阳性组中的表达无统计学意义，说明bFGF在肿瘤血管生成中有密切关系而与淋巴结转移无关。

    HIF_1α、bFGF促进肿瘤血管生成的机制肿瘤血管生成是一个复杂的病理过程，众多生长因子已被发现在血管生成中起调控作用。HIF_1α通过各种机制调节肿瘤血管生成，是血管生成的核心调控因子。研究表明，乳腺癌细胞株(T47D)中bFGF通过激活PI_3K/Akt和MEK1/ERK信号通路，以时间和剂量依赖性的方式诱导HIF_1α表达，共同促进VEGF释放［11］。

    本实验结果显示，在乳腺癌组织中HIF_1α与bFGF的表达呈正相关(rs=0?314，P<0?05)，说明HIF_1α及bFGF在乳腺癌血管生成中可能具有协同效应。肿瘤发生时?①通过自分泌或旁分泌bFGF，促进肿瘤细胞增殖，随着肿瘤不断生长、体积增大，肿瘤因血供不足发生缺氧坏死，缺氧状态下HIF_1α表达增强，②bFGF通过激活细胞内PI_3K/Akt和MEK1/ERK信号通路，进一步促进HIF_1α表达，HIF_1α与靶基因VEGF的缺氧反应组件结合，促进VEGF转录增强［8］，从而诱导新生血管生成。

    综上所述，HIF_1α和bFGF在乳腺癌的发生、发展和血管生成中起重要作用。通过阻断HIF_1α、bFGF刺激血管生长的信号途径，或通过研究HIF_1α、bFGF的天然抑制剂或基因干扰来抑制乳腺癌中HIF_1α、bFGF表达及新生血管的形成，对预防乳腺癌局部复发、抑制转移、提高生存率可能具有积极意义并成为和预防乳腺癌的重要手段。

【】
  ［1］Giampietro G. Clinical importance of determination of tumor angiogenesis in breast carcinoma:Much more than a new prongnostic tool［J］. Journal of Clinical Oncology, 1995, 13(3): 765-782.

［2］白秉学， 徐东刚， 范明，等. 碱性成纤维细胞生长因子的研究进展［J］. 国外医学·遗传学分册， 2004， 27(4)： 197-199， 213.

［3］Dickson C, Spencer DB, Dillon C, et al. Tyrosine kinase signalling in breast cancer: fibroblast growth factors and their receptors［J］. Breast Cancer Res, 2000, 2(3): 191-196.