CYP2B6基因表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达

【摘要】  目的：构建CYP2B6基因原核表达质粒，在大肠杆菌［Rosetta2(DE3)pLysS］中高效表达重组蛋白。方法：以质粒为模板，用PCR技术扩增出CYP2B6基因，并将其分别插入pET_22b(+)、pET_28b(+)和pET_32a(+)质粒中，经PCR、测序鉴定后，转化Rosetta2(DE3)pLysS，并用异丙基_β_D_硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果：经PCR、测序鉴定，构建了CYP2B6基因表达质粒；采用考马斯亮蓝染色法检测重组蛋白表达，pET_22b(+)_CYP2B6未见目的蛋白表达；pET_28b(+)_CYP2B6有目的蛋白表达，约占蛋白总量的5%；而pET_32a(+)_CYP2B6可以高效地表达CYP2B6，在低浓度(50μmol/L)IPTG诱导3h后，所表达的CYP2B6蛋白约占细菌总蛋白的30%；质谱分析结果进一步证实所表达的蛋白为CYP2B6。结论：成功地使CYP2B6基因在原核系统中高效表达。

【关键词】  CYP2B6 大肠杆菌 表达

    ［Abstract］Objective: To construct the expression plasmids of CYP2B6 gene, and to express CYP2B6 protein in Escherichia coli［Rosetta2(DE3)pLysS］. Methods: TheCYP2B6genewasamplifiedbyPCRtechniquefromthetemplate of the plasmid containing CYP2B6 gene, then was inserted into plasmidsofpET_22b(+),pET_28b(+),andpET_32a(+)respectively, and identified with PCR and sequencing. The recombinant expression plasmids containing CYP2B6 gene were transformed into Rosetta2(DE3)pLysS and the target protein expression was induced by isopropyl_β_D_thiogalactopyranoside(IPTG). Results: The recombinant plasmids of pET_22b(+)_CYP2B6, pET_28b(+)_CYP2B6, and pET_32a(+)_CYP2B6 were obtained and identified by PCR and sequencing. Commassie Blue staining method was used to detect thetarget protein expression. The pET_22b(+)_CYP2B6 could not express target protein, the pET_28b(+)_CYP2B6 could express CYP2B6 protein accounting for about 5% of total protein; The target protein was greatly expressed by pET_32a(+)_CYP2B6 and the expression level of CYP2B6 protein was to be approximately 30% after 3hours induction in the concentration of 50 μmol/L IPTG. The expressed protein was CYP2B6 protein by the mass spectrometry results. Conclusion: CYP2B6 is successfully constructed, which can highly express objective protein in Rosetta2(DE3)pLysS.

    ［Key Words］CYP2B6; Escherichia coli; expressionCYP450(cytochrome P450)

　　系统是机体对内、外源性物质，尤其是药物进行生物转化的重要酶系。CYP450是一个超家族，目前已确定的人类CYP450分属于18个家族，42个亚家族［1］。在人体药物代谢过程中，主要有CYP1、CYP2和CYP3 3个家族。CYP2B6是CYP2家族中重要成员之一，它在肝脏中表达量差异比较大，可能与启动子区域单个核苷酸多态性(SNP)有关［2］；另外，在其他位置的SNP与酶的活性变化也有一定的关系［3,4］。这种遗传性因素决定着一些药物的个体化用药，如影响到CYP2B6的酶活性，或涉及到CYP2B6代谢的药物。为了更好地研究药物对CYP2B6酶活性的影响，筛选药物之间的相互作用，迫切需要在体外进行相关试验。本研究的目的是在大肠杆菌中进行高水平表达CYP2B6，为体外活性研究打下基础。

    1 材料与方法

    1?1主要试剂大肠杆菌(Rosetta2(DE3)pLysS、XL_1)为本室保存菌种；含有CYP2B6基因的质粒由Code等［5］惠赠；高保真Taq酶pfu购自Promega公司(美国)；载体［pET_22b(+)、pET_28b(+)和pET_32a(+)］购自Merck公司(美国)；限制性内切酶BamHI、XhoⅠ、BglⅡ，T4DNA连接酶购自NEB公司(英国)；胰化蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司(美国)；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、异丙基_β_D_硫代半乳糖苷(IPTG)等购自Sigma公司(美国)；其他试剂为国产分析纯试剂。

    1?2引物设计与合成根据CYP2B6基因的序列设计引物，sense: 5′CGGGATCCGATGGAACTCAGCGTCCTCCT3′， antisense:5′CCGCTCGAGGCGGGGCAGGAAGCGGATCTG3′由上海博亚公司合成。其中GGATCC与CTCGAG为BamHI和XhoⅠ的酶切位点，其前面的碱基为保护序列。

    1?3 CYP2B6基因扩增及克隆取10ng含有CYP2B6基因的质粒为模板，加入20μmol/L引物2?5μL，10×buffer 5μL，10mmol/L dNTP 1μL,5U/μL pfu 0?5μL，H2O 39μL。PCR扩增条件：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，30循环；72℃ 5min。PCR产物经BamHI和XhoⅠ酶切，切胶纯化基因片段。pET_22b(+)和pET_28b(+)经BamHI和XhoⅠ酶切，而pET_32a(+)经BglⅡ和XhoⅠ酶切，纯化载体酶切产物与CYP2B6基因片段连接，转化XL_1。挑取菌落进行鉴定，并提取质粒测序。

    CYP2B6蛋白的诱导表达将重组质粒［pET_22b(+)_CYP2B6和pET_32a(+)_CYP2B6］转化Rosetta2(DE3)pLysS，挑取单个菌落，接种于3mL含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中培养过夜。取过夜培养物1mL接种于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中培养2h，测定OD600值约0?6时加入IPTG(终浓度50μmol/L)继续培养，分别于3、6h取1mL菌液。以未加IPTG诱导的各重组质粒转化细菌培养物为对照。重组质粒［pET_28b(+)_CYP2B6］采用的培养基含卡那霉素(50μg/mL)，其诱导表达方法同上。

    1?5 重组蛋白检测将细菌培养物1mL离心收集细菌，用TE重悬细菌，并加适当的蛋白上样缓冲液，煮沸5min后进行SDS_PAGE电泳，并经考马斯亮蓝染色，确定蛋白有无表达。

    1?6质谱分析将目的蛋白从SDS_PAGE胶上切下，经胰蛋白酶消化处理后，用ABI7700质谱仪(ABI公司，美国)对目的蛋白进行分析。

    2结果

    2?1 CYP2B6基因克隆至表达载体将扩增的CYP2B6基因片段与表达载体酶切，连接后转化XL_1，挑取克隆用PCR方法鉴定，提取质粒，应用T7启动子、T7终止子为引物，测序结果证实克隆到了全长的CYP2B6基因，且无任何碱基突变。所构建的质粒(以pET_32a(+)_CYP2B6为例)如图1。

 
    2?2 CYP2B6蛋白的诱导表达将重组质粒转化Rosetta2(DE3)pLysS，以低浓度(50μmol/L)IPTG进行诱导，分别诱导不同时间后，取1mL菌液进行检测。pET_22b(+)_CYP2B6在诱导3、6和12h后，未见特异性蛋白表达，即使以高浓度(0?8mmol/L)IPTG诱导，也未见目的蛋白表达(结果未列出)；而pET_28b(+)_CYP2B6有目的蛋白表达，约占总蛋白量的5%左右，分子质量约为50ku，与预期分子质量相符(图2)。pET_32a(+)_CYP2B6在低浓度(50μmol/L)IPTG诱导下，在分子质量60ku处有一特异性带出现，与预期CYP2B6重组蛋白分子质量相符(与pET_28b(+)比，多一个trxA，11ku左右)，随着诱导时间的增加，未见蛋白表达量增加，于诱导3h后，约占总蛋白量的30%左右(图3)。

    2?3CYP2B6质谱分析将表达的目的蛋白从SDS_PAGE胶上切下，经胰蛋白酶处理后，用ABI7700质谱仪分析(图4)，将所得的分子质量在数据库中检索，证实为蛋白CYP2B6。质谱分析结果(箭头所指为分子质量标准，余标记为片段分子质量)

    3讨论

　　CYP450蛋白是一类含血红素酶，负责催化多种外源、内源性化合物生物转化的重要酶系［1,6］。临床上大多数药物都需经CYP450代谢，所以一些候选药物在临床应用前需经CYP450代谢检测。尤其是近年，新药的不断出现以及2种或以上药物同时应用对药物疗效的影响越来越受到重视，迫切需要应用体外系统能快速、高通量检测对CYP450酶活性的影响。因此重组蛋白CYP450在药物代谢研究中具有重要的价值。CYP2B6是CYP450基因家族中一个重要的酶，它涉及了许多药物的代谢过程，所以该蛋白异源性表达一直是研究的热点。在临床药物过程中，经常会出现2种或以上药物同时或先后应用，使得药物作用效果出现增强或减弱的现象，其主要原因就是引起CYP450酶活性的诱导和抑制。为了更好地进行临床配伍用药，达到良好的治疗效果，目前多家公司开发出一些进行体外检测药物相互作用的荧光探针方法［7］。在检测系统中，一个主要的酶是CYP2B6。CYP2B6的异源表达系统主要有酵母［8,9］、细菌等，但酵母系统纯化繁琐，所涉及的成本较高，而原核系统在这一方面具有明显的优点。一些研究者在利用大肠杆菌表达CYP2B6的过程中，在培养基中加入一些诱导剂［10］，使得CYP2B6蛋白在细菌中的表达量有所提高，但大多需长时间(24～72h)或低温诱导表达，且表达量并不高。本研究目的是提高CYP2B6在大肠杆菌中的表达量。首先采用了高效表达的pET_22b(+)、pET_28b(+)和pET_32a(+)。pET_22b(+)具有pelB信号，该信号肽有助于目的蛋白分泌到周间质中；pET_28b(+)对目的蛋白修饰最少；pET_32a(+)载体具有trxA，它有助于蛋白的可溶性表达。将构建的表达重组质粒转化常用的表达BL21(DE3)中，在50、200、600、800和1000μmol/L IPTG诱导下，用SDS_PAGE检测目的蛋白，这3个重组质粒均未见目的蛋白表达(结果未列出)。随后，以Rosetta2(DE3)pLysS作为表达菌，该细菌含有一些表达真核蛋白所需的稀有密码子，同时该细菌可以表达少量的T7溶菌酶，此酶为T7RNA聚合酶的抑制物，有助于目的蛋白的表达调控。pET_22b(+)_CYP2B6在Rosetta2(DE3)pLysS中仍无表达；pET_28b(+)_CYP2B6有少量蛋白表达；而pET_32a(+)_CYP2B6在低浓度(50μmol/L)IPTG诱导3h即可见目的蛋白表达，约占细菌总蛋白量的30%。以上结果提示Rosetta2(DE3)pLysS所提供的稀有密码子对CYP2B6的表达有重要意义。质谱分析结果进一步证实所表达的蛋白为CYP2B6。本研究对CYP2B6蛋白在原核系统表达进行了摸索，为CYP2B6蛋白的酶活性研究打下了基础，为减少药物研究成本带来希望。

【】
  ［1］Nelson DR. Cytochrome P450 nomenclature, 2004［J］.Me_thods Mol Biol, 2006, 320: 1-10.

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