兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶的功能性表达、纯化及活性鉴定

【摘要】  目的：用原核蛋白表达系统对兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)进行功能性表达，并对其活性进行鉴定。方法：从兔肝中克隆出NRDR全长序列，运用Gateway表达系统将其编码区序列构建到表达载体(pDEST 17)上，再转化到大肠杆菌(E.coli)(BL21_AI)中表达出兔NRDR蛋白并鉴定其表达形式；取工程菌裂解上清通过金属离子亲和层析纯化出目的蛋白，再运用反相高效液相色谱法(HPLC)测定该酶的Km值和Vmax值。结果：构建出含兔NRDR编码区(768bp)的表达克隆，转化到BL21_AI中表达出氨基端含6×His标签的重组兔NRDR蛋白，诱导表达4h后目的蛋白可占总蛋白量的41?4%；经一步亲和层析得到的兔NRDR纯度为97?2%，比活性提高了64倍；经HPLC测定，该酶对视黄醛的Km值为(4?55±0?33)μmol/L，Vmax为(0?307±0?065)μmol/(min·mg)。结论：应用pDEST 17可在BL21_AI中对兔肝NRDR进行高效的功能性表达。

【关键词】  辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶 表达 纯化 类视黄醇代谢

    ［Abstract］Objective: To express the rabbit NADP(H)_dependent retinol dehydrogenase/reductase(NRDR)in prokaryotic expression system functionally, and to identify its enzyme activity.Methods: The total NRDR sequence was cloned from the rabbit liver and the coding region of NRDR was constructed to the Gateway_based expression vector (pDEST 17), which was transformed into the Escherichia coli(E.coli)(BL21_AI)for the protein expression. After sonication and centrifugation of the bacteria, the soluble NRDR in supernatant was purified by affinity chromatography. Furthermore, the kinetic parameters of NRDR were determined by high performance liquid chromatography(HPLC).Results: The expression vector with the desired gene(768 bp)was constructed, and then, the NRDR protein, which was harvested at the optimal time point(4 hours after induction), was successfully expressed with a 41?4% expression level. Moreover, the homogeneous enzyme was obtained by a one_step affinity chromatography, with purity up to 97?2% and specific activity 64 fold enhanced. The values of the Km and the Vmax were(4?55±0?33)μmol/L and(0?307±0?065)μmol/(min·mg), respectively. Conclusion: The functional rabbit NRDR can be expressed effectively in BL21_AI by pDEST 17.

    ［Key Words］NADP(H)_dependent retinol dehydrogenase/reductase；expression；purification；retinoids metabolism

    维甲酸是脊椎动物体内重要的生理活性物质，通过调节基因的转录参与细胞生长、形态发生、细胞分化、免疫功能调节等生理过程［1,2］。维甲酸在体内是由视黄醇(维生素A)经两步代谢而成，中间代谢产物为视黄醛，即视黄醇视黄醛视黄酸。辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶［NADP(H)_dependent retinol dehydrogenase/reductase，NRDR］是从兔肝中发现并纯化的一种酶，具有很强的视黄醇氧化与视黄醛还原活性［3］。视黄醇与视黄醛之间的转化反应是体内维甲酸合成的限速步骤，因此NRDR在调节生物体内维甲酸的稳态过程中起着重要作用［4,5］。由于直接在肝中提纯该酶步骤相对较为复杂，而且提纯过程中目的蛋白易于变性并失去酶活性，从而对该酶的深入研究造成一定困难。本研究拟采用大肠杆菌(E.coli)表达系统对NRDR进行表达、纯化及功能鉴定，为其进一步研究打下基础。

    1材料与方法

    1?1 材料

    1?1?1动物

    新西兰大白兔(汕头大学医学院实验动物中心提供)。

    1?1?2主要试剂AMV逆转录酶(TaKaRa公司，日本)；Trizol试剂、Pfx高保真DNA聚合酶和应用Gateway技术的E.coli蛋白质表达系统(Invitrogen公司，美国)；胶回收试剂盒(上海华舜公司，)；质粒提取试剂盒(Qiagen公司，德国)；SuperSignal West HisProbeTM试剂盒(Pierce公司，美国)；镍琼脂糖凝胶(Ni2+ Agarose)(Amersham公司，瑞典)；还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、全反式视黄醇、全反式视黄醛、咪唑(Sigma公司，美国)；HPLC级甲醇、乙腈(Fisher公司，美国)；其他为进口或国产分析纯试剂。

    1?2方法

    1?2?1PCR引物4对引物见表1。表1PCR引物

    1?2?2兔NRDR编码区cDNA克隆及全长扩增 经耳静脉空气栓塞将兔处死后取肝，匀浆处理后以Trizol试剂提取兔肝总RNA，在DU650紫外分光光度计(Beckman公司，美国)上测定OD260/280以确定纯度和含量。取约1μg总RNA，以Oligo dT(15)为引物，在AMV酶作用下于42℃反应60min，逆转录生成cDNA，冰浴终止反应。根据兔NRDR全长序列(GeneBank登录号：AB045133)设计引物S1和R1，以cDNA为模板进行PCR扩增：94℃2min；94℃30s，50℃30s，68℃1min，35个循环；68℃5min。

    1?2?3表达载体构建设计出编码区带attB重组位点的修饰引物，因其较长，需采用接头PCR(Adapter PCR)法进行扩增。第一轮以NRDR全长扩增序列为模板，S2、R2为引物进行PCR扩增:94℃2min；94℃30s，55℃1min，68℃1min，30个循环；68℃5min。以此PCR产物为模板，S3、R3为引物进行下一轮PCR扩增：95℃2min；94℃20s，55℃30s，68℃1min，9个循环；68℃5min。以第2次PCR产物为模板，S3、R3为引物进行第3轮PCR扩增：95℃2min；94℃20s，45℃30s，68℃1min，8个循环；94℃20s，55℃30s，68℃1min，22个循环；68℃5min。回收扩增片断，按Gateway表达系统说明配置反应液，室温孵育过夜进行BP重组反应，将NRDR编码区构建到供体载体pDONRTM201中，形成Gateway系统入门克隆，并转化至E.coli DH5α，筛选出阳性克隆，扩大培养后提取质粒送广州英骏公司测序确认，引物为P1、P2。将入门克隆与Gateway表达系统的pDEST 17(氨基端带6×His标签)进行LR重组反应，反应产物转化至DH5α，接种于LB固体选择性培养基(含氨苄霉素100 μg/mL)倒置培养过夜。挑取过夜培养的单菌落以S2、R2为引物进行菌落PCR筛选，并选出阳性菌株，扩大培养后提取质粒，转化至BL21_AITM，以S2、R2为引物进行菌落PCR筛选，并选出阳性菌株，此菌株即为ORDR于Gateway系统的原核表达菌株。

    1?2?4兔NRDR在BL21_AI中的表达用含100μg/mL氨苄西林的LB培养液对表达菌株进行培养(温度37℃，转速230r/min)，在细菌达到对数生长期(OD600≈0?4)时加入L_阿拉伯糖作为诱导剂，每隔1h取样，连续取样4次。将不同培养时间产物进行十二烷基磺酸钠_聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS_PAGE)分析确定最佳蛋白表达时间。细菌诱导培养至最佳表达时间后，以4 000g离心10min后收集菌体，以25mmol/L、pH7?4 PBS重悬，并洗涤2次，再次重悬后加溶菌酶至100μg/mL，冰上孵育30min，于400W下超声裂菌，每超声10s间隔10s，共15～20次。裂解液于4℃以15000g离心10min，分别取上清液及沉淀物进行SDS_PAGE分析和活性测定，确认蛋白表达形式。通过HisProbeTM_HRP对表达蛋白进行Western blot测定，进一步确定蛋白表达及其分布比例，采用BandScan及Quantity One软件进行分析。

    1?2?5表达蛋白活性的测定及纯化在冰上配置反应体系：25mmol/L PBS 440μL，30μmol/L NADPH 5μL，细菌裂解液上清50μL。37℃预热3min，加入30mmol/L溶于二甲基亚砜的视黄醛5μL，于37℃以200r/min振荡孵育10min，加入同体积反应终止液(甲醇/正丁醇＝95/5，含100μg/mL二叔丁对甲酚(BHT)终止反应。充分混合后10000g离心1min，分离出有机相(上清液)。取有机相20μL进行高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)分析，应用C18反相色谱柱，以乙腈(85%)和30mmol/L乙酸胺(15%)混合液为流动相、流速1?5mL/min、检测波长325nm，分析确定视黄醇的生成量。应用Ni2+亲和层析技术对重组兔NRDR进行纯化。取1?5mL Ni2+Agarose装柱，将细菌裂解液上清30mL过柱，以平衡缓冲液(20mmol/LpH7?4的磷酸纳缓冲液，含0?5mol/L NaCl及10mmol/L咪唑)平衡约10个柱体积后分别以含250、500mmol/L咪唑的洗脱缓冲液(20mmol/LpH7?4的磷酸纳缓冲液，含0?5mmol/L的NaCl)进行洗脱(体积3～4个柱体积，流速1mL/min)。取流出液进行蛋白定量、活性测定、SDS_PAGE分析。

    1?2?6 纯化蛋白活性的测定

    对视黄醇溶液［(1～100)μmol/L］进行HPLC分析，其条件见1?2?5，绘制出视黄醇浓度_峰体积定量曲线。在500μL25mmol/L PBS(pH7?4)中加入1μg纯化重组蛋白和0?3mmol/L NADPH，分别测定视黄醛浓度为2、4、8、10μmol/L时视黄醇的生成。反应3min，其余条件见1?2?5，分离出有机相后室温下离心真空干燥，将干燥产物重溶于50μL反应终止液中，取20μL重溶溶液按上述方法测定视黄醇的生成，实验重复3次，使用双倒数法该酶对于视黄醛的动力学常数。

    2 结果

    2?1入门克隆的构建扩增出兔NRDR全长序列后将其构建到pDEST_17中，通过菌落PCR产物的琼脂糖电泳分析进行验证。兔NRDR编码区全长768bp，该对引物可扩增出27bp的attB重组位点序列，预计扩增序列全长795bp，菌落PCR结果显示成功扩出目的片断。

    2?2 NRDR在BL21_AI中的表达入门克隆经LR反应获得表达克隆，转化至BL21_AI后经筛选挑取阳性克隆菌株进行菌落PCR，确认目的片断成功导入。挑取其中一个单菌落扩大培养分析表达效果。图2示表达菌株在诱导1h后即可见目的蛋白(分子质量：29?6ku)表达，随着时间的增加表达量也逐步提高，经BandScan软件分析，表达后1～4h的目的蛋白表达量分别占总蛋白的21?4%、35?7%、37?6%、41?4%，由此确定表达最佳时间为诱导后4h。 L4～7：分别为表达菌株诱导1～4h将培养菌裂解后离心，分别取上清液及沉淀物进行SDS_PAGE分析及活性测定，由SDS_PAGE(图3，L1～4)及Anti_His Western blot(图3，L5～7)可见大部分蛋白在沉淀中，即主要以包涵体形式存在，Quantity One软件分析Western blot结果显示可溶性蛋白及包涵体分别占表达总蛋白量的18?2%和81?2%。

    2?3 表达蛋白的活性测定在活性测定实验中发现细菌裂解液的上清中存在明显活性，说明有一部分蛋白通过可溶形式表达，为了避免繁琐的包涵体复性过程，直接取上清进行活性测定。图4示部分视黄醛被还原成视黄醇，说明上清中含有具视黄醛还原活性的NRDR蛋白。

     2?4 表达蛋白的纯化目的蛋白经Ni2+Agarose柱后大部分附着于凝胶上，用250、500mmol/L的咪唑溶液先后洗脱后收集洗脱液。经过活性测定、SDS_PAGE分析，确定目的蛋白主要在含500mmol/L咪唑的洗脱缓冲液中(图5)，目的蛋白(29?7 ku)在SDS_PAGE上均为一条带，经BandScan软件分析纯度为97?2%。根据活性测定，纯化后的兔NRDR比活性提高了64倍，蛋白回收率70?6%，100mL细菌培养液约可获得纯化蛋白100μg。

    2?5 纯化蛋白活性测定使用空白对照确定视黄醛、视黄醇保留时间分别为9?67min和12?45min，反应体系加入纯化蛋白后可以看到明显的视黄醛消耗和视黄醇的生成，说明该纯化蛋白有很高的催化视黄醛成为视黄醇活性。使用不同浓度视黄醛检测在不同底物浓度下催化的初始速度，应用双倒数法得出该酶对于视黄醛的Km值为(4?55±0?33)μmol/L；Vmax为(0?307±0?065)μmol/(min·mg)(图6)。

    3 讨论

  肝脏是视黄醇类物质代谢的中心调节器官及作用靶器官［6］，NRDR的活性已在多种哺乳动物肝中得以证实，其中以兔肝中所提纯的酶活性最高［3］，因此本研究采用兔NRDR为目的基因进行表达。兔NRDR的氨基酸序列TASTDGIG20～27与S145_Y164_K168符合短链脱氢酶(SDR)的2个主要保守模序，属于SDR家族［7］。SDR家族的N端序列多为亲脂序列，一般起膜粘附作用［8］，未见其影响酶活性的相关报道。兔NRDR cDNA序列(GenBank登录号：DQ229_110)在5′端有2个潜在的翻译起始位点［9］，通过对纯化的天然NRDR进行N端测序发现，其N端从第2个AUG(起始密码子)后第5个氨基酸开始。根据序列分析及课题组的初步实验，天然NRDR氨基端之前的这段序列主要在蛋白定位方面起重要作用［10］，对活性影响不大。因此我们构建兔NRDR重组蛋白的编码序列从第2个AUG后第5个氨基酸开始，而且氨基端片段带上6×His标签及部分载体序列，结果表明重组的兔NRDR蛋白仍有较高活性，而且活性与报道天然NRDR相差无几［3］，证明该氨基端序列对酶活性影响不大。构建入门克隆时，由于需要在编码区序列两端加上61bp的attB重组位点，用普通的PCR方法难以扩增出需要的序列。本研究采用接头PCR的方法分3次反应逐步把两端的attB重组位点连接到目的片段上，而且退火时先在较低温度下反应几个循环再把温度升高，在保证反应特异性的同时增加了反应灵敏度。E.coli中表达的外源蛋白多以包涵体的形式存在，人NRDR在E.coli中的表达未能获得可溶性蛋白［4］，本研究所表达的重组蛋白也大部分以包涵体形式存在(81?8%)。NRDR为活性很高的氧化还原酶，大量表达时可能对宿主细胞有很大毒性，因此我们推测它在细胞内很难以活性形式大量存在，当大量表达时即表现为不溶的包涵体形式。虽然包涵体经过一系列变性、复性过程能得到可溶性的目的蛋白，但该过程操作繁琐，而且蛋白损失量大，大大增加了目的蛋白的获取难度和成本。本研究得到的重组蛋白有一部分(18?2%)处于溶解状态，而且具有相当高的还原视黄醛的活性，因此是一个有效的功能性表达系统，可以稳定而又简便地获取NRDR蛋白。本研究构建的表达系统能够稳定地表达功能性NRDR蛋白，而且氨基端附带的6×His标签使其能通过金属离子亲和层析一步纯化获得高纯度蛋白，为进一步研究NRDR的功能及其在脊椎动物体内的作用奠定了基础。

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