侧脑室注射匹罗卡品引起内源性洋地黄素释放抑制肾皮质Na+_K+ATP酶

【摘要】  目的：探讨激活SD大鼠脑内胆碱能M受体对内源性洋地黄素(EDLF)释放及肾皮质Na+_K+ATP酶活性的影响。方法：侧脑室注射M受体激动剂匹罗卡品，放射免疫法测定血清EDLF水平，化学比色法测定肾皮质Na+_K+ATP酶活性。结果：①侧脑室注射匹罗卡品引起大鼠血清EDLF水平显著升高(P<0.01)，肾皮质Na+_K+ATP酶活性抑制(P<0.01)。②侧脑室注射阿托品可阻断匹罗卡品引起的血清EDLF水平升高和肾皮质Na+_K+ATP酶活性抑制效应。结论：脑内胆碱能系统可通过M受体介导参与EDLF释放的调节。

【关键词】  M受体 匹罗卡品 阿托品 内源性洋地黄素 肾皮质Na+_K+ATP酶

　　［Abstract］Objective: To investigate the possible effect of pilocarpin microinjection into cerebroventricule on level of serum endogenous digitalis_like factor(EDLF)and activity of renal cortical Na+_K+ATPase in rats. Methods: After intracerebroventricular administration of pilocarpin(10 μg/rat), the serum EDLF level was determined with the radioimmunoassay and the activity of renal cortical Na+_K+ATPase was determined with chemical assay. Results: After intracerebroventricular injection of pilocarpin, the serum EDLF level was increased and the activity of renal cortical Na+_K+ATPase was decreased obviously, which could be blocked by administration of M_receptor antagonist atropine(20 μg). Conclusion: The intracerebroventricular microinjection of pilocarpin can increase EDLF release mediated by central muscarinic receptor.

　　［Key Words］M receptor；pilocarpin；atropine；endogenous digitalis_like factor；renal cortical Na+_K+ATPase

　　脑内胆碱能系统与机体钠水排出的调节有密切关系，在侧脑室、第三脑室或下丘脑外侧等部位分别注射胆碱能受体激动剂氨甲酰胆碱可引起排钠、排钾和利尿反应,这种效应可被M受体阻断剂和N受体阻断剂阻断［1，3］。内源性洋地黄素(Endogenous digitalis_like factor, EDLF)是来自下丘脑和肾上腺、通过抑制Na+_K+ATP酶活性而发挥排钠利尿、强心和缩血管等作用的生物活性物质［2］。脑内胆碱能刺激的排钠利尿效应是否与EDLF释放有关尚未见报道。本实验通过选择性激活脑内胆碱能M受体，观察血清EDLF水平及肾皮质Na+_K+ATP酶活性的变化，试图就脑内胆碱能M受体对EDLF的释放及肾皮质Na+_K+ATP酶活性的影响进行探讨。

　　1  方法

　　1.1  实验动物与分组
   
　　实验用SD大鼠(第三军医大学实验动物中心提供)27只，体质量180～250g，雌雄不拘，并随机分为人工脑脊液组(7只,侧脑室注射人工脑脊液5μL)、匹罗卡品组(7只,侧脑室注射匹罗卡品10μg)、人工脑脊液预处理组(7只,侧脑室注射5μL人工脑脊液10min后再注射匹罗卡品10μg)和阿托品预处理组(6只,侧脑室注射阿托品20μg预处理10min后再注射匹罗卡品10μg)。乌拉坦(1g/kg)腹腔注射麻醉后，埋植侧脑室导管(AP 5mm，L 1.5mm，深度3.5mm)。注射药物均用人工脑脊液稀释(NaCl 7.46g，KCl 0.19g，CaCl2 0.14g，MgCl2 0.19g稀释至1000mL)。侧脑室注射后30min分别取动脉血和肾皮质用于测定血清EDLF水平和肾皮质Na+_K+ATP酶活性。

　　1.2  血清EDLF水平测定
   
　　取动脉血1mL，室温下凝固，3000r/min离心10min，取血清置-20℃冰箱保存备用。用放射免疫法测定全部血清样本中EDLF水平，具体步骤严格按试剂盒(北方生物技术所,。批号8911，批内差异<7%，批间差异<12%)说明书进行。

　　1.3  肾皮质Na+_K+ATP酶活性测定
   
　　取0.2g肾皮质，加入1mL冷NS,超声粉碎制成匀浆。取匀浆以4000r/min离心15min，留上清液待测。钼酸法测定肾皮质Na+_K+ATP酶活性，操作严格按试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国)说明书进行。肾皮质Na+_K+ATP酶活性以每毫克肾皮质组织总蛋白中Na+_K+ATP酶每小时分解ATP产生的无机磷(Pi)的量表示(μmol Pi/mg Pr·h)。样品中总蛋白含量用考马斯亮蓝法测定,试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

　　1.4  统计学处理
   
　　各组数据以±s表示，组间差异用t检验。

　　2  结果

　　2.1  侧脑室注射匹罗卡品对血清EDLF水平和肾皮质Na+_K+ATP酶活性的影响
   
　　匹罗卡品组血清EDLF水平显著升高、肾皮质Na+_K+ATP酶活性显著下降。匹罗卡品组血清EDLF水平显著高于人工脑脊液组(P<0.01)，而肾皮质Na+_K+ATP酶活性显著低于人工脑脊液组(P<0.01,表1)，显示侧脑室注射匹罗卡品可引起EDLF释放增加、肾皮质Na+_K+ATP酶活性抑制。

　　2.2  侧脑室注射阿托品预处理对侧脑室匹罗卡品效应的作用
   
　　阿托品预处理组血清EDLF水平显著低于人工脑脊液预处理组(P<0.01)，而肾皮质Na+_K+ATP酶活性显著高于人工脑脊液预处理组(P<0.01)，显示侧脑室注射阿托品预处理可阻断匹罗卡品引起的EDLF释放增加和肾皮质Na+_K+ATP酶活性抑制(表1)。

　　表1  侧脑室注射匹罗卡品对血清EDLF水平和肾皮质Na+_K+ATP酶活性的影响（略）

　　Table 1  Effect of intracerebroventricular injection of pilocarpin on serum EDLF level and the activity of renal cortical Na+_K+ATPase

　　与人工脑脊液组比  1)P<0.01；与人工脑脊液预处理组比  2)P<0.01

　　3  讨论
   
　　研究发现扩张狗血容量后，其血浆提取物中具有排钠利尿活性的物质，若将狗头游离后，再扩张血容量这一反应便消失；毁损第三脑室前腹侧部,同样也可使血容量扩张所致的Na+_K+ATP酶抑制效应消失［4,5］。显示中枢神经系统释放抑制Na+_K+ATP酶活性因子在机体水钠排出的调节中起作用［4,5］。业已证明，下丘脑可释放具有较强抑制Na+_K+ATP酶活性的EDLF［2］。本实验观察到向大鼠侧脑室注射选择性胆碱能M受体激动剂匹罗卡品，可引起血清EDLF水平显著升高，向侧脑室注射M受体阻断剂阿托品预处理，可阻断侧脑室注射匹罗卡品引起的EDLF水平升高效应，表明脑内胆碱能的刺激可引起EDLF释放增多，该作用由胆碱能M受体介导。
   
　　侧脑室注射氨甲酰胆碱后,引起显著的促钠排泄反应，而阻断胆碱能M受体可以完全抑制脑室注射氨甲酰胆碱引起的上述效应［3］，其作用机制尚未完全阐明，有人还发现脑内胆碱能系统参与了侧脑室注射高渗盐水引起的排钠、排钾和利尿效应［6］。我们先前的实验观察到脑室内注射高钠人工脑脊液引起EDLF释放增加并抑制肾脏Na+_K+ATP酶活性［7］，提示侧脑室内胆碱能系统可影响下丘脑EDLF释放，进而影响肾皮质Na+_K+ATP酶活性。本实验观察到在大鼠侧脑室注射选择性胆碱能M受体激动剂匹罗卡品，血清EDLF水平升高、肾皮质Na+_K+ATP酶活性显著下降；用M受体阻断剂阿托品预处理，可阻断侧脑室注射匹罗卡品引起的EDLF水平升高效应和肾皮质Na+_K+ATP酶抑制效应，表明脑内胆碱能刺激可能通过增加EDLF释放而抑制肾皮质Na+_K+ATP酶活性，显示脑内胆碱能刺激引起的排钠利尿反应可能与中枢EDLF释放增多进而抑制肾小管Na+_K+泵活性有关。

【】
  　　［1］姜春玲, 林茂樟. 大鼠脑室内注射氨甲酰胆碱对肾钠、钾、水排出的影响［J］. 生报, 1994, 46: 361-368.

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　　［3］王春艳， 孙雷, 王敏, 等. 氨甲酰胆碱引起的促钠排泄反应和下丘脑室旁核胆碱乙酰转移酶免疫阳性反应变化［J］. 神经解剖学杂志, 2005, 21: 309-331.

　　［4］Bloch KD. Ouabain induces secretion of pro_ANP by rat atrial cardiocytes［J］. Am J Physiol， 1988， 255: 383.

　　［5］Doris PA. Immunological evidence of endogenous digitalis_like factor［J］. Endocriology, 1988, 123: 24-40.

　　［6］Rocha MJA, Franct CR, Antunes RJ. Participation of cholinergic and adrenergic synapses of the medial septal area (MSA)in the natriuretic and kaliuretic response to intraventricular hypertonic saline(NaCl)［J］. Physiol Behave, 1985, 34(1): 23-25.

　　［7］王勇, 张成标, 陈远寿, 等. 侧脑室注射高钠脑脊液对内源性洋地黄样因子释放和肾Na+_K+ATP酶活性的影响［J］. 遵义医学院学报, 2001, 24: 301-303.