成年SD大鼠心肌细胞分离及其胞内钙离子动态变化测定
【摘要】 目的：建立稳定的成年SD大鼠心肌单细胞分离方法，并对心肌细胞内Ca2+动态变化进行测定。方法：用改进的Langendorff装置，行大鼠主动脉插管逆向灌流(温度、pH、水质恒定)，用混合液(0.6mg/mL胶原酶Ⅱ+0.06mg/mL蛋白酶+1mg/mL牛血清白蛋白)消化心脏，经3次不同浓度含钙台式液复钙后得到钙稳态心肌细胞；室温静置1～2h后于激光共聚焦显微镜下测定Ca2+的动态变化。结果：得到70%～90%长杆状活细胞，钙稳态心肌细胞可占40%～60%；fluo_4 AM负载染色后可记录到典型的诱发钙瞬变。结论:胶原酶和蛋白酶混合液主动脉逆向灌流方法可以得到具有正常生理功能的钙稳态心肌细胞，可用于心肌细胞内钙信号研究。
【关键词】 大鼠 心肌细胞 细胞分离 激光共聚焦显微镜
Cardiomyocyte Isolation from Adult SD Rat Heart for Confocal Microscopic Intracellular Ca2+ Imaging
［Abstract］Objective: To develop a stable method for adult SD rat single cardiomyocyte isolation， and then to determine the intracellular Ca2+ signalling by confocal imaging. Methods: Rat heart was digested by aorta retrograde perfusion with mixture［collagenaseⅡ(0.6 mg/mL), pronase(0.06 mg/mL)and bovine serum albumin(1 mg/mL)］using a modified Langendorff system. The temperature, pH and water quality should be properly controlled in the process of digested rat heart. Three times of re_calcification with different concentration of Ca2+ Tyrode solution were used to procure calcium homeostasis ventricular cardiomyocytes. Single cell was used for confocal microscopic Ca2+ imaging after storage at room temperature for 1～2 hours. Results: There were about 70%～90% rod_shaped fresh viable cells, in which 40%～60% were calcium homeostasis cells. In single calcium homeostasis cardiomyocytes calcium transients could be evoked by a stimulator and recorded with an LSM510 confocal microscopic system after incubation with fluo_4 AM. Conclusion: Aorta retrograde perfusion with collagenaseⅡ and pronase is a proper method to procure single calcium homeostasis cardiomyocytes from adult SD rat with normal physiological features, and fit for confocal microscopic Ca2+ imaging.
［Key Words］rat; cardiomyocyte; cell isolation; laser scanning confocal microscopy
随着心脏疾病研究的不断，具备正常生理功能的单个心肌细胞已成为研究心脏代谢、功能、病理生理机制的重要基础，心肌细胞内钙离子浓度(［Ca2+］i)变化是一系列心脏疾病的诱因及病理基础。激光扫描共聚焦显微镜的应用，可使人们对活细胞的多种功能进行直接的观察和精确的动态分析，其中对心肌细胞内［Ca2+］i变化的动态检测即为主要应用之一［1～3］。本文主要探讨心肌单细胞的分离方法并用激光共聚焦显微镜和fluo_4 AM负载方法检测分离所得心肌细胞内Ca2+的动态变化，为心肌细胞内钙信号研究及其系列研究工作奠定基础。
1 材料与方法
1.1 动物与试剂
实验动物：清洁级成年SD大鼠(广州南方医科大学实验动物中心提供)65只，雌雄不拘，体质量200～300g。主要试剂：胶原酶Ⅱ(277u/mg,Invitrogen公司，美国)，蛋白酶(5.8u/mg)、牛磺酸、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES(Sigma公司，美国)，fluo_4 AM(Molecular Probes公司，美国)，其余试剂为国产AR试剂。
1.2 溶液组成及配制
1.2.1 台式液(mmol/L，用NaOH调节pH 7.35～7.45) NaCl 136.9，KCl 5.4，CaCl2 1，MgCl2 1，NaH2PO4 1，HEPES 10，Taurine 10，D_glucose 11.1。
1.2.2 无钙台式液(mmol/L，用NaOH调节pH 7.35～7.45) NaCl 136.9，KCl 5.4，MgCl2 1，NaH2PO4 1，HEPES 10，Taurine 10，D_glucose 11.1。
1.2.3 酶液 胶原酶Ⅱ液+蛋白酶液(酶液A)：取无钙台式液25mL加入胶原酶Ⅱ液15mg、蛋白酶液1.5mg混匀并用0.22μm滤器过滤。胶原酶Ⅱ液(酶液B)：取无钙台式液15mL加入胶原酶Ⅱ液9mg混匀并用0.22μm滤器过滤。
1.2.4 复钙液 复钙液A：取无钙台式液加入CaCl2至0.1mmol/L，BSA至1mg/mL。复钙液B：取无钙台式液加入CaCl2至0.5mmol/L。BSA至1mg/mL。复钙液C：取台式液加入BSA至1mg/mL。
1.3 细胞分离
腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，无菌状态下迅速开胸摘心，并置于4℃左右无钙台式液中清洗血污，剪除多余脂肪组织及修剪主动脉长度，立即行主动脉插管(深度不可超过主动脉瓣)，将心脏挂于Langendorff装置下，用丝线结扎固定：首先用台式液灌流，可见心脏恢复跳动，从而排清心房、心室及血管内残留血液，2min后换无钙台式液灌流，当心脏停止跳动且滴下灌流液体大致为无色后换用酶液A灌流；单向灌流约2min后改为循环灌流20～30min；剪下心室(心脏下1/3)，在预置含37℃ 5～7mL酶液B的三角瓶中剪碎，37℃恒温摇床60次/min摇匀消化5min；吸取上层细胞悬液，500r/min离心1min。弃上清液后加入复钙液A 5mL静置复钙15min(使心肌细胞沉降)；弃上清液后加入复钙液B 5mL静置复钙15min；弃上清液后加入复钙液C 5mL静置复钙15min；弃上清液并加入台式液静置室温1～2h后即可负载fluo_4 AM Ca2+荧光染料染色应用于LSM510 META型激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss公司，德国)下心肌细胞内Ca2+动态测定。剩余酶解的心室组织残渣可重新加入酶液B重复上述操作。灌流消化过程中维持7.5～10.0kPa的压力［4］，所有液体均用0.22μm滤器过滤除菌且用体积分数95%的O2+体积分数5%的CO2混合气体饱和，灌流温度保持在35℃，实验室温度保持在20～30℃。
2 结果
2.1 心肌单细胞的形态学观察
具备正常生理功能的单个心肌细胞呈长杆状或条柱状或矩形，横纹清晰(图1，封2)，且对锥虫蓝拒染。置于台式液中处于静息状态的即为钙稳态心肌细胞，偶见自发收缩；若持续自发收缩则表示胞内钙稳态失衡，提示细胞处于濒死状态。采用本方法可得40%～60%钙稳态心肌细胞。死亡及损伤严重的细胞呈团块状或可见大量颗粒，并被锥虫蓝染色。
2.2 心肌单细胞的钙瞬变
将分离好的心肌细胞与fluo_4 AM［孵育浓度(10～15)μmol/L］孵育15min，弃上清液去除细胞外Ca2+荧光染料后加入台式液，孵育好染料的细胞置于共聚焦显微镜的载物台上，显微镜配置为：波长488nm的氩激光，40倍、1.3NA的油浸镜头；共聚焦成像采用面扫描方式，可得到静息心肌细胞内Ca2+分布图(图1，封2)。在线扫描方式下，通过触发连接可使SEN_7203型刺激器与LSM_510型共聚焦显微镜同步工作得到心肌细胞的诱发钙瞬变图像(图2，封2)［5］。
3 讨论
自Powell等［6］于1976年首先成功分离出单个钙耐受成熟心室肌细胞以来，几十年间研究者一直为提高良好心肌细胞获得率和减低细胞的钙异常而不懈探索。心肌细胞分离的每一步都对最终分离的细胞状态产生重要的影响。实验室温度、Langendorff装置设定温度、心脏摘取速度、水质、溶液的pH值、酶的活力及浓度、操作者的熟练程度等都可影响心肌细胞状态，不利于激光共聚焦显微镜下心肌细胞内Ca2+动态变化的测定。
本研究的结果表明四步法是分离心肌细胞的较好方法①灌流台式液使离体心脏恢复跳动从而排除心腔及心脏冠状动脉系统内的残留血液；②灌流无钙台式液以消减心肌细胞间Ca2+依赖的紧密连接，有助于细胞外基质的解离［7］；③灌流酶液A［8］；④停止灌流剪取心室肌组织，剪碎后加入酶液B再次消化5min可使细胞间连接消化更完全，从而得到游离的杆状细胞。
分离心肌细胞时酶消化的终止时间很重要，消化酶的浓度过高及消化时间过长都可造成细胞膜不可修复的损害［9］。有报道认为当心脏颜色变黄，表现较松弛时终止酶消化较合适［7］。我们的经验是：酶消化持续20～30min时，心脏呈浅白色，用眼科镊夹持感觉较软，且滴下的灌流液可见单个心肌细胞，此时终止消化较合适。心肌细胞体积较大，经过酶液灌流消化后细胞膜损伤已较严重，故剪碎心肌组织后余下步骤要轻柔，离心时间要尽量缩短，加入液体及弃上清液动作要轻，避免液体流速过快。
三步不同递增梯度复钙液复钙，对本研究目的测定正常生理状态下心肌细胞内［Ca2+］i的动态变化很重要，既是为了补偿细胞内钙库中Ca2+由于无钙台式液灌流分离造成的丢失，也有使心肌细胞逐步适应正常Ca2+浓度的作用，降低由于钙浓度迅速增大到生理浓度引起心肌细胞内钙失衡的概率，所以心肌细胞的梯度复钙恢复钙库内的钙存储量是必须而重要的。心肌细胞与fluo_4 AM的孵育过程中应注意所加染料的温度、浓度、孵育时间及避光，分装的染料为-20℃保存故加入台式液后需等待其温度升至35℃左右时方可加入细胞沉淀中；fluo_4 AM孵育浓度为(10～15)μmol/L，37℃孵育15min为佳，增大染料浓度可减少孵育时间；孵育结束弃上清液后加入台式液，弃上清液应完全，则可降低图片背景荧光强度；fluo_4 AM染料见光易分解故孵育染色过程及上机检测均需注意避光。
总之，液体配制、分离细胞过程、复钙、孵育染色过程等对细胞的生理活性都有重要影响。任何一步的疏忽都会影响到分离细胞的成活率和细胞状态，最终影响激光共聚焦显微镜下心肌细胞内钙信号的研究。
【】
［1］Cheng HP, Wei CL, Wei LP, et al. Calcium signaling in physiology and pathophysiology［J］. Acta Pharmacol Sin, 2006, 27(7): 767-772.
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［6］Powell T, Twist VW. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium［J］. Biochem Biophys Res Commun, 1976, 72(1): 327-333.
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