甲胺对大鼠内皮的慢性毒理研究

【摘要】  目的：探讨Wistar大鼠体内低剂量甲胺的慢性分布是否能导致氨基脲敏感型胺氧化酶(SSAO)活性上调而诱导内皮的损伤。方法：甲胺组20只、对照组10只分别给以甲胺(50mg/kg)、NS(50mL/kg)持续灌胃6个月后，取胸主动脉免疫组化染色，光镜下观察血管假性血友病因子(vWf)的表达；取升主动脉及心内膜透射电镜下观察内皮细胞的超微结构。检测血浆中SSAO活性、NO及甲醛浓度。结果：甲胺组血浆SSAO活性及甲醛浓度均高于对照组，NO浓度低于对照组，但两组比无统计学意义(P>0.05)。vWf在甲胺组内膜、内膜下层均有较明显表达，对照组只有弱表达。甲胺组内皮细胞超微结构呈不规则及浓缩核，对照组内皮细胞呈现正常细胞超微结构。结论：低剂量甲胺在大鼠体内的慢性分布能够诱导内皮损伤。

【关键词】  氨基脲敏感型胺氧化酶 甲胺 内皮 慢性毒理

　　［Abstract］Objective: To explore whether chronic administration of methylamine of mini_dose in Wistar rats might induce the elevation of semicarbazide_sensitive amine oxidase(SSAO)activity and initiate endothelial injury. Methods: The methylamine group(20)and control group(10)were intragastricly administrated with methylamine(50mg/kg) and NS(50mL/kg), respectively. After six months, the thoracic aortas were stained with immunohistochemistry and observed the expression of von Willebrand factor(vWf)under light microscope. The ultrastructure in the ascending aorta and endocardium were observed by transmission electron microscopy. SSAO activity, NO and formaldehyde concentration in the plasma were detected. Results: Although the SSAO activities, formaldehyde concentration were higher and NO concentration was lower in the methylamine group, compared with control group, the difference was not statistically significant. The strong expression of vWf could be observed in endothelium and subendothelium in the methylamine group, however, weak expression in the control group. The endothelial ultrastructure in the methylamine group showed irregular and shrinking nucleus, the control group represented normal endothelial morphology. Conclusion: The chronic distribution of methylamine of mini_dose in rats can induce endothelial injury.

　　［Key Words］semicarbazide_sensitive amine oxidase; methylamine; endothelium; chronic toxicity

　　甲胺是一种外源性或内源性胺类，目前研究表明甲胺的慢性暴露能通过氨基脲敏感型胺氧化酶(SSAO)催化代谢生成甲醛、Ｈ２Ｏ２和氨等代谢产物而诱导血管损伤［1～3］。但是关于外源性甲胺对血管内皮的影响了解甚少。本实验用低剂量甲胺对Wistar大鼠灌胃6个月以建立慢性中毒动物模型，通过观察大鼠体重改变、血浆SSAO活性、甲醛、NO浓度及内皮损伤指标的变化，进一步了解甲胺和血浆SSAO对内皮的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  仪器与试剂
   
　　仪器：Agilent1100高效液相色谱系统(Agilent公司，美国)；酶标仪(Thermo Labsystems公司，芬兰)；Hitachi_300透射显微镜(Hitachi公司，日本)；荧光显微镜(蔡司公司，德国)。试剂：甲胺盐酸盐(Sigma公司，美国)；NO试剂盒(南京建成生物有限公司，)；兔抗人血管性假血友病因子(vWf)多克隆抗体(Chemicon公司，美国)；HRP_DAB系统细胞兼组织染色试剂盒(R&D公司，德国)；其它化学试剂为分析纯。

　　1.2  慢性中毒动物模型建立
   
　　Wistar大鼠(广州南方医科大学实验动物中心提供)30只，雌雄各半，体质量0.180～0.205kg，随机分成对照组(10只)和甲胺组(20只)。甲胺组按5mL/kg的质量分数40％盐酸甲胺溶液［100mL NS溶解1g盐酸甲胺，依照大鼠盐酸甲胺LD50范围配制，其LD50(1.6～3.2)g/kg］灌胃。对照组以相同方式给予相同体积NS。大鼠禁食(不禁饮)大约8h后于早晨8：00灌胃(连续6d，停1d)。11：00～12：00AM恢复进食。星期天自由饮食。每两周称量大鼠体重，依据体重调整给药量。1周1轮回，灌胃持续6个月。

　　1.3  样本采集
   
　　大鼠灌胃后6个月，行戊巴比妥腹腔麻醉，先心脏采动脉血离心得血浆分装储存于－70℃冰箱，再活体灌注固定液［体积分数2％的多聚甲醛、体积分数2.5％的戊二醛和0.1moL/L的磷酸盐缓冲液的混合液(pH 7.4)］。固定好的胸主动脉修成4～5mm环以制作蜡块，升主动脉及心内膜修成1mm×1mm×1mm大小以备透射电镜分析。

　　1.4  NO测定
   
　　NO浓度测定采用硝酸还原酶法。用酶标仪在550nm波长测定吸收光值。按照NO试剂盒要求进行操作和浓度。

　　1.5  血浆SSAO活性及甲醛浓度测定
   
　　SSAO活性测定［4］：苯甲胺作为测定SSAO活性的底物。0.2mL的血浆用氯吉林在室温下孵化30min以抑制单胺氧化酶的活性。然后加入180μL苯甲胺在37℃水浴1h，用2，4_二硝基苯肼与酶促反应产物苯甲醛反应生成衍生物，用高效液相色谱方法(紫外检测)分析。
   
　　血浆甲醛浓度测定［5］：0.2mL分装血浆、0.1mL氨苄西林溶液(2.5mg/mL)、0.25mL三氯乙酸(体积分数20%)和0.8mL的水加入一玻璃瓶，30min强力漩涡混匀后，玻璃瓶(90℃)加热1h。反应产物用乙醚萃取。萃取液在40℃下氮气吹干，得到干燥产物用体积分数50%乙腈_水溶解，然后用反相高效液相色谱法(荧光检测)分析。

　　1.6  免疫组化
   
　　固定好胸主动脉，并经系列梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡后制成蜡块；4μm组织切片粘贴于载玻片上；组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精、蒸馏水水化后用微波抗原修复(高档4min后换低档15min)；体积分数3％ H２Ｏ２ 5min以消除内源性过氧化物酶；卵白素封闭液15min、缓冲液洗涤2次；生物素封闭液15min；加兔抗人多克隆抗体(1∶100)4℃过夜、缓冲液漂洗15min×3次；再加生物素二抗37℃孵育40min，用缓冲液漂洗2次；再加HSS_HRP三抗37℃孵育30min，用缓冲液漂洗2次；DAB显色10min；苏木精对比染色；碳酸锂反蓝。封固后组织切片在显微镜下拍照。

　　1.7  超微结构分析
   
　　固定好升主动脉与心内膜，并用磷酸缓冲液漂洗15min×3次，体积分数2％饿酸(1mL/样本)固定1h，再用磷酸缓冲液漂洗3次，体积分数50％酒精漂洗15min，加入饱和醋酸铀染色后，再酒精脱水，经Epon812渗透包埋制成胶囊，用钻石刀切成50nm厚薄片，经醋酸铀和柠檬酸铅染色，用透射电镜观察。

　　1.8  统计学处理
   
　　实验结果用SPSS12.0统计软件分析，采用独立样本t检验，结果用±s表示。

　　2  结果

　　2.1  Wistar大鼠体重变化情况
   
　　甲胺组体重较对照组轻(表1)，但两组比无统计学意义(P>0.05)。

　　表1  不同月份Wistar大鼠的体重（略）

　　Table 1  The body weight of Wistar rats in various month

　　2.2  血浆SSAO活性、NO及甲醛浓度的测定结果
   
　　甲胺组以甲胺灌胃6个月后，血浆SSAO活性、NO及甲醛浓度分别为(1.85±0.29)nmoL/h·mL、(24.76±16.62)μmol/L、(1.38±0.26)μg/mL，对照组以NS灌胃6个月后，血浆SSAO活性、NO及甲醛浓度分别为(1.69±0.17)nmol/h·mL、(41.07±39.68)μmol/L、(1.19±0.14)μg/mL。甲胺组NO浓度低于对照组，SSAO活性及甲醛浓度高于对照组，但P>0.05。

　　2.3  免疫组化及超微结构结果
   
　　阴性对照片不着色(图1A，封2)。vWf在对照组胸主动脉有较弱表达(图1B，封2)。甲胺组胸主动脉(图1C，封2)内膜及内膜下层可见程度较深的黄染，表明vWf有强表达。甲胺组升主动脉内的内皮细胞超微结构(图2A，封2)显示胞浆空泡化，表明细胞有脂肪样改变，另外，胞核呈不规则及浓缩。甲胺组心内膜内皮细胞(图2C，封2)胞核呈不规则及浓缩。而对照组升主动脉内皮细胞(图2B，封2)及心内膜内皮细胞(图2D，封2)显示正常内皮细胞超微结构。

　　3  讨论
   
　　甲胺广泛存在于酒、香烟和食物中，但它达不到急性中毒的剂量［6,7］。甲胺对培养的内皮细胞相对无毒性，但易被SSAO脱氨在体内或体外生成甲醛、Ｈ２Ｏ２及氨而表现毒性作用。甲醛能促进动脉粥样硬化并与糖尿病并发症有密切关联，它能与Ｈ２Ｏ２协同作用造成细胞损害［9］。因此，甲胺在体内的慢性分布可能是人类血管性疾病的一个潜在的危险因素。内皮是覆盖在心脏、血管(血管内皮)、淋巴管(淋巴内皮)和躯体浆膜腔的一层薄薄单层上皮。此外，内皮还是一个十分活跃的代谢及内分泌器官。内皮的完整是防止血栓形成所必需的，其损伤或功能障碍是病理性血栓形成的重要原因。内皮对血管紧张性的正常调节机制被破坏是慢性高血压发病的重要原因之一。内皮功能异常可以体现在其分泌合成功能的异常，体现为血浆中NO、vWf的变化。随着损伤进一步加重，可以导致内皮形态学上的改变。
   
　　vWf是一种由激活或损伤的内皮细胞及血小板合成的一种多肽二硫聚合物［10］。由内皮细胞产生的大多数vWf有两种类型：vWf二聚体被分泌到血浆和内膜下基质中；颗粒状的vWf被储存在内皮细胞的Weibel_Palade小体内而被迅速代谢清除。vWf的外渗对疾病的发病机制起着重要作用［11,12］。本实验用免疫组化的方法检测vWf在胸主动脉内膜中的表达情况，甲胺组与对照组比，vWf分泌从内膜到内膜下明显增多，表明甲胺的慢性作用能诱导内皮的损伤从而导致vWf分泌增多，从而可能进一步导致血栓形成。另外内皮细胞的超微结构表明甲胺组内皮细胞呈胞浆空泡化、不规则及浓缩核等病理改变，而对照组呈正常内皮形态结构，这进一步证实外源性甲胺在体内的慢性蓄积能导致内皮细胞的损伤。
   
　　体内NO由底物L_精氨酸经一氧化氮合酶催化生成。它是一种内皮细胞源性舒张因子，可明显改变血管壁的张力，涉及健康内皮的调节功能。研究表明高血压病与血管内皮合成NO减少有密切关系，NO活性减弱是动脉粥样硬化危险因素的早期标志［13］。本实验中，甲胺组较对照组血浆NO浓度降低，但无统计学意义(P>0.05)。因大鼠连续采血较难操作，未能连续监测血浆中NO浓度的变化，因此，这一结果是否有普遍性还是由实验动物个体差异导致，有待进一步探讨。
   
　　本实验中，经连续6个月的体重监测，甲胺组与对照组间无统计学意义(P>0.05)，说明灌胃过程中低浓度甲胺溶液对大鼠胃肠道无损伤，同时表明该剂量的甲胺及其代谢产物对大鼠体重无明显影响。另外，甲胺组血浆SSAO活性与甲醛浓度与对照组比无统计学意义(P>0.05)，但有升高趋势。

【】
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