磷脂双分子层辅助的疏水氨基酸的缩聚研究

【摘要】  目的：研究磷脂双分子层对疏水氨基酸色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸缩聚反应的影响。方法：活化氨基酸的聚合反应在囊泡体系和对照缓冲溶液中进行，反应产物用高效液相色谱_质谱联用仪进行分离检测。结果：两种体系中都有氨基酸的缩聚产物_寡肽的生成。结论：对磷脂双分子膜亲合力较强的氨基酸，磷脂双分子层对其缩聚反应显示了明显的辅助作用。

【关键词】  磷脂双分子层 氨基酸 寡肽 缩聚反应

　　［Abstract］Objective: To investigate the effect of lipidic bilayers on the polycondensation of hydrophobic amino acids(trptophan, phenylalanine, methione, leucine, isoleucine, and valine). Methods: The polycondensation of amino acids in liposome system as well as in aqueous buffer solution was started from amino acid_N_carboxyanhydrides(NCAs). The reaction products were analyzed with HPLC_MS. Results: Amino acid_NCAs oligomerize into polypeptides in both systems. Conclusion: The presence of lipidic bilayers can assist the polycondensation of amino acids to varying extent depending on their membrane affinity.

　　［Key Words］liposome; amino acid; oligopeptides; polycondensation

　　对生命起源的化学研究实际上是基于如何从简单分子和简单反应创造出功能化的复杂分子。1953年Miller模拟远古条件合成了氨基酸，从而走出了分子进化的第一步［1］。但低分子量的分子还没有解决生命如何起源的问题，需要进一步探讨功能化大分子(如蛋白质和核酸)的形成［2］。有报道，过磷脂双分子层(囊泡)对色氨酸的缩聚反应有明显的辅助作用［3,4］。本文将系统研究疏水氨基酸色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、蛋氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)的缩聚反应，通过比较不同结构的疏水氨基酸在磷脂双分子层体系和对照缓冲溶液中的反应，氨基酸与磷脂双分子层的相互作用对氨基酸缩聚反应的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  仪器与试剂
   
　　HP1050 LC高效液相色谱(HPLC)_HP1100 MSD质谱(MS)联用仪(惠普公司，美国)。棕榈硬脂酰磷酯酰胆碱(POPC)和1?1′_羰基二咪唑(CDI)(Sigma_Aldrich公司，美国)。氨基酸及其它试剂均为分析纯。

　　1.2  方法
   
　　POPC囊泡体系的制备、氨基酸_N_羰基_环内酸酐(氨基酸_NCA)的聚合反应以及HPLC和MS分析方法［4］：将POPC溶解在氯仿中，常压旋转蒸发除去溶剂，隔夜真空干燥；然后加入一定量的咪唑(0.4mol/L)/盐酸(对照)缓冲溶液(pH　6.80)，分别在液氮中冷冻、40℃水浴中解冻，重复冷冻解冻过程10次制得POPC囊泡体系。将氨基酸(40mmol/L)溶解在对照缓冲溶液中；氨基酸溶液与过量2.5倍的CDI在0℃下反应2min；得到的氨基酸_NCA溶液(40mmol/L)将其分别与对照缓冲溶液和POPC囊泡体系(40mmol/L)按1∶1(v∶v)混合，在室温下震荡12h，得到的产物用HPLC_MS联用仪分离检测，其条件同［4］。

　　2  结果

　　2.1  氨基酸_NCA的制备及聚合反应机理
   
　　氨基酸的缩聚反应从氨基酸_NCA开始。氨基酸_NCA及其硫代物可能是生命起源之前存在的化合物［5～7］。氨基酸溶液与CDI反应产物的MS检测结果证实了存在氨基酸_NCA和N_咪唑羰基氨基酸，说明氨基酸与CDI的反应及其后续的缩聚反应是依照Ehler等［8］提出的机理进行的(图1)。

　　图1  氨基酸_NCA的制备及其聚合成寡肽的反应（略）

　　Fig.1  Preparation of amino acid_NCA and its polymerisation into oligopeptides

　　2.2  不同结构疏水氨基酸的缩聚反应

   
　　将新鲜制备的氨基酸_NCA溶液与对照缓冲溶液和POPC囊泡体系混合，在室温下振荡12h。此时MS分析检测不到氨基酸_NCA和N_咪唑羰基氨基酸，说明氨基酸_NCA的聚合反应完成。反应产物用HPLC和MS进行分离和检测。典型的Phe缩聚产物的HPLC图见图2，从中可以看到明确分离的组分峰。由MS检测可知组分峰为寡聚Phe，其聚合度用数字在每一组分峰上部标出。通过测量组分寡肽峰在215nm(寡聚色氨酸在280nm下测量)的吸光度值且对时间积分可以近似对寡肽的产率进行定量分析(假定每个氨基酸单体的摩尔吸光系数在聚合成寡肽后近似不变)。各氨基酸缩聚后生成的寡肽的组分峰面积(对应寡肽的产率)随聚合度变化的关系见图3。

　　图2  缓冲溶液(A)和POPC囊泡体系(B)中寡聚Phe产物的HPLC色谱图（略）

　　Fig.2  HPLC chromatograms of products of oligo_Phe in reference buffer(A)and in liposome(B)

　　图3  POPC囊泡对不同氨基酸的缩聚产物色谱峰面积(产率分布)的影响（略）

　　Fig.3  Effect of POPC liposomes on peak areas(yields distribution)of oligopeptides obtained from polycondensation of amino acids

　　从图2、3中可以看出，在对照缓冲溶液和POPC囊泡体系中氨基酸_NCA都缩聚生成不同聚合度的寡肽。但POPC囊泡体系的存在对寡肽的产率和分布具有不同程度的影响，其明显地提高了高聚合度的寡聚Trp、寡聚Phe和寡聚Met的产率，但对寡聚Leu、寡聚Ile和寡聚Val的产率和分布影响不大。例如，对照缓冲溶液中可检测到的聚合度最高的寡聚Phe为7聚体，但在POPC囊泡体系中可明显检测到10聚体的生成。而且，POPC囊泡体系中聚合度较高的Phe(5聚体或更高)的产率明显高于对照缓冲溶液中的产率。

　　3  讨论
   
　　POPC囊泡对氨基酸缩聚反应的不同程度的辅助作用可以用POPC双分子层与氨基酸的相互作用(即氨基酸的亲膜性)来解释。氨基酸的亲膜性可用将氨基酸从水相转移到POPC界面的自由能变ΔG来衡量［9］。Trp、Phe、Met、Leu、Ile和Val的ΔG分别为-1.85,-1.13,-0.83,-0.56,-0.31和0.07kJ/mol［9］。因此可以解释为：具有较低的ΔG值或亲膜性较强的氨基酸可以在POPC双分子层界面处富集，因此具有较高的局部浓度，有利于较高聚合度的寡肽的生成。另一方面，由亲膜性氨基酸形成的寡肽也具有高的亲膜性和溶解度，因此富集于POPC双分子层界面，并在此延长生成高聚合度的寡肽。例如，Trp具有最高的亲膜性，因而观察到POPC囊泡对其缩聚反应的最显著的辅助作用。Leu、Ile和Val的亲膜性较弱，没有明显观察到POPC囊泡对其缩聚反应的辅助作用。
   
　　综上所述，本文研究了不同疏水氨基酸(Trp、Phe、Met、Leu、Ile和Val)_NCA在对照缓冲溶液和POPC囊泡体系中的缩聚反应。HPLC和MS等研究表明，两种体系中都生成了寡肽，POPC双分子层的存在可以选择性地辅助亲膜性较强的氨基酸的缩聚反应。

 

【】
  　　［1］Miller SL. A production of amino acids under possible primitive earth conditions［J］. Science, 1953, 117, 528-529.

　　［2］Zaia DAM. A review of adsorption of amino acids on minerals: Was it important for origin of life［J］. Amino Acids, 2004, 27(1): 113-118.

　　［3］Markus B, Liu D, Walde P, et al. Liposome_assisted selective polycondensation of α_amino acids and peptides［J］. Macromolecules, 1999, 32: 7 332-7 334.

　　［4］Markus B, Liu D, Luisi PL. Liposome_assisted selective polycondensation of α_amino acids and peptides: the case of charged liposomes［J］. Macromolecules, 2000, 33: 5 787-5 796.

　　［5］Huber C, W?chtersh?user G. Peptides by activation of amino acids with CO on(Ni,Fe)S surfaces: Implications for the origin of life［J］. Science, 1998, 281: 670-672.

　　［6］Brack A. Selective emergence and survival of early polypeptides in water［J］. Origins Life Evol Biosphere, 1987, 17: 367-379.

　　［7］Liu R, Orgel LE. Polymerization of α_amino acids in aqueous solution［J］. Origins Life Evol Biosphere, 1998, 28: 47-60.

　　［8］Ehler KW, Orgel LE. N,N′_carbonyldiimidazole_induced peptide formation in aqueous solution［J］. Biochem Biophys Acta, 1976, 434: 233-243.

　　［9］White SH, Wimley WC. Hydrophobic interactions of peptides with membrane interfaces［J］. Biochim Biophys Acta, 1998, 1 376, 339-352.