表没食子儿茶素没食子酸酯诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的实验研究
【摘要】 目的：观察表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）诱导人肝癌(SMMC-7721)细胞系，细胞凋亡的生物学效应。方法：通过MTT比色法检测EGCG对SMMC-7721细胞生长的影响；应用细胞计数法研究不同浓度EGCG对SMMC-7721细胞生长曲线的影响；PI染色流式细胞术研究EGCG对SMMC-7721细胞周期和凋亡率的影响。结果：EGCG显著抑制人肝癌SMMC-7721细胞的生长，呈浓度依赖性；SMMC-7721细胞经EGCG作用后，其细胞群体倍增时间明显延长，细胞增殖周期延长，从而细胞增殖速度减慢；流式细胞术分析结果表明EGCG（30 μg/mL、60 μg/mL、120 μg/mL）处理SMMC-7721细胞48 h后，G1期细胞累积均逐渐增加。结论：EGCG具有诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用，其机制可能与使细胞周期G1期阻滞相关。
【关键词】 肝肿瘤；表没食子儿茶素没食子酸酯；细胞周期；凋亡
Abstract Objective:To investigate the effect of epigallocatechin-3-gallate on induction of apoptosis in liver cancer cell line SMMC-7721.Methods:The growth inhibition of SMMC-7721 cells was measured by MTT assay.Cell couting method was used to test the influence of growth curve in SMMC-7721 cells treated with different concentrations of EGCG.The apoptosis rate and cell cyle of SMMC-7721 cells were determined by PI staining flow cytometry.Results:EGCG significantly inhibited the growth of SMMC-7721 cells,in a concentration dependent manner.Cell counting showed that average doubling time increased by EGCG in a concentration dependent manner.PI staining flow cytometry showed that cell cyle was arrested at G1 phase and the apoptosis of SMMC-7721 cells was induced by EGCG in a concentration dependent manner.Conclusion:EGCG posseses antitumor effect in vitro,its mechanism might be associated with G1 phase cell cycle arrest.
Key words Liver neoplasms;Epigallocatechin-3-gallate;Cell cyle;Apoptosis
肿瘤的发生与细胞凋亡有密切关系，细胞凋亡调控的失调是导致肿瘤形成的一个重要条件［１］。近些年，因为茶及其组分对人健康的潜在益处使得对茶的研究越来越广泛。绿茶含有特殊的多酚物质，主要是儿茶素。绿茶儿茶素中表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）含量最高而且生物活性最强，能明显抑制肿瘤细胞的生长。其具体机制尚不十分清楚，可能与其诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期、诱导分化和抗肿瘤转移等有关［２］。利用EGCG处理不同的肿瘤细胞，均显示有较强的抑制肿瘤细胞增殖的效应。研究表明，EGCG对前列腺癌［３］、肺癌［４］、白血病［５］、鼻咽癌、大肠癌、宫颈癌等肿瘤均有较强的抑制作用。肿瘤细胞的一个共同特征是细胞周期调控机制的破坏导致细胞的失控性生长。众多的癌基因、抑癌基因参与细胞生长、分裂、死亡的调控，最终表现为对细胞周期的调控。我们推测EGCG可能通过诱导SMMC-7721细胞周期阻滞而发挥其抑制增殖的效应。 因此，本研究对EGCG进行了体外抗肿瘤活性测定,并应用流式细胞术分析其对肿瘤细胞周期的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
细胞及细胞培养： 人肝癌细胞SMMC-7721由中科院上海细胞生物学研究所引进。用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液，在37 ℃，5%CO2混合气体,95%湿度的培养箱内培养，取对数生长期细胞用于实验。
药品与试剂：EGCG：Sigma公司产品，纯度95%。小牛血清：杭州四季青生物工程公司产品，MTT为Amresco公司产品。
1.2 方法
1.2.1 MTT比色法测定：取对数生长期细胞，接种于96孔平底培养板，每孔180 μL(含0.9×104细胞)。培养6 h后加入处理因素并设空白对照，使EGCG的终浓度为 20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL每组设4个平行孔，继续培养48 h。然后每孔加入MTT 20 μL（5 mg/mL），4 h后即终止培养，弃上清液，每孔加入200 μL DMSO，振荡摇匀，置酶联免疫检测仪在570 nm波长处测量吸光度（A）值，按以下公式细胞增殖抑制率：抑制率=（1-试验组A值/对照组A值）×100%。
1.2.2 生长曲线及倍增时间测定：①取对数生长期细胞,常规胰酶消化制备单细胞悬液，调节细胞密度为2×104/mL，接种于24孔板, 每孔1 mL(2×104细胞/孔)，培养6 h待细胞贴壁后分别加入处理因素并设空白对照，使EGCG的终浓度为20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL每个浓度设3个复孔,以上实验重复三次。②台盼蓝染色法细胞计数；采用台盼蓝染色法分别计活细胞数和死细胞数,加9滴细胞悬液与1滴台盼蓝液均匀混合后,于显微镜下观察细胞所呈现的颜色,死细胞被染成淡蓝色,活细胞由于其细胞膜完整,对台盼蓝拒染,而不着色,折光性好。连续计数4 d,每孔计数3次取平均数绘制细胞生长曲线,按公式TD=tlg2/(lgNt-lgN0)(TD为细胞倍增时间,t代表培养时间,N0及Nt分别代表接种后及培养t h后的细胞数)计算细胞倍增时间。
1.2.3 PI染色流式细胞术分析：收集SMMC-7721细胞2×107,1 000 rpm×5 min离心，4 ℃预冷的PBS溶液重悬细胞,离心,1 000 rpm×5 min,重复一次。用4 ℃预冷的70%乙醇2 mL固定细胞（4 ℃，48 h～72 h）充分混匀。上机检测，进行细胞周期和DNA含量分析。
1.2.4 统计学处理：采用SPSS10.0统计学软件，实验结果（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，确定P＜0.05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1. EGCG对SMMC-7721细胞生长的抑制作用
MTT比色法测定结果显示：EGCG显著抑制SMMC-7721细胞的增殖活性，呈浓度依赖性。20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL EGCG作用SMMC-7721细胞48 h，细胞生长抑制率分别为12.62%、26.28%、52.34%、62.56%、69.04%、80.35%（见图1）。EGCG对SMMC-7721细胞作用48 h的IC50值为60.68 μg/mL。
2.2. EGCG对SMMC-7721细胞生长的影响
EGCG对肿瘤细胞(SMMC-7721) 细胞生长的影响(见图2)。从中可以看出,前72 h，EGCG为20 μg/mL时,对其生长曲线无明显影响,与对照组曲线非常接近；40 μg/mL～100 μg/mL浓度范围内EGCG从培养第48 h开始对SMMC-7721细胞均有不同程度的抑制作用,曲线明显下降,并且随着浓度的增加和作用时间的延长,生长曲线下降逐渐明显，呈浓度和时间依赖性。
2.3. SMMC-7721细胞群体倍增时间
常规培养的SMMC-7721细胞群体倍增时间为32.25 h，20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的EGCG可使细胞群体倍增时间分别延长到37.72 h、43.01 h、56.44 h、80.27 h、97.64 h，表明SMMC-7721细胞经EGCG作用后，其细胞群体倍增时间明显延长，细胞增殖周期延长（P＜0.05）。
2.4. PI染色FCM分析EGCG对SMMC-7721细胞周期与凋亡的影响
在DNA图谱G0/G1期前出现一个代表细胞凋亡的亚G1期峰,对亚G1期峰进行定量分析,可了解凋亡细胞的比率。30 μg/mL、60 μg/mL、120 μg/mL EGCG作用48 h后可使人肝癌SMMC-7721的G1期分别为47.5%、51.0%、61.8%，与对照组（43.6%）相比差异具有显著性（P＜0.05）。对照组SMMC-7721细胞的凋亡率为2.7%，用30 μg/mL、60 μg/mL、120 μg/mL EGCG作用48 h，凋亡率分别为2.1%（P＞0.05）、16.5%、18.3%，凋亡率随浓度的增高依次增高（P＜0.05）。
3 讨论
肝癌是在我国发病率和死亡率均居首位的恶性肿瘤，传统的手术、放射治疗、化疗治疗等疗效较差，5年生存率很低。目前，绿茶抗癌作用的研究日益被受关注。
MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。本文运用MTT比色法检测EGCG对SMMC-7721细胞增殖的影响。结果显示：EGCG对SMMC-7721细胞作用48 h的IC50值为60.68 μg/mL，能有效地抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖活性，呈浓度依赖性（P＜0.05 VS control）。
采用台盼蓝染色细胞计数法绘制生长曲线，观察药物对肿瘤细胞生长的影响。结果显示：EGCG对SMMC-7721细胞生长均有抑制作用，呈浓度依赖性；当EGCG浓度由20 μg/mL增加到100 μg/mL时，其细胞群体倍增时间由37.72 h延长到97.64 h，表明SMMC-7721细胞经EGCG作用后，其细胞群体倍增时间明显延长，细胞增殖周期延长，从而导致细胞增殖速度减慢（P＜0.05 VS control）。
细胞周期存在一个复杂而又精细的调控机制,其调控异常是细胞癌变的重要事件,细胞周期调控因子也是参与癌变过程的调节位点。恶性肿瘤细胞的细胞周期调节失控,细胞分化受阻,使细胞成过度增殖状态。在细胞周期G1、S、G2和M四个时期中,有功能不同的调控点,其中关键是G1/S期调控点和G2/S期调控点。因此，用药物阻滞肿瘤细胞周期进程和诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物治疗恶性肿瘤的主要作用方［６］。
细胞周期能否启动进行细胞增殖,主要调控点在G1期,它决定细胞是否通过G1期进入S期。本实验FCM结果表明,EGCG具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，当不同浓度EGCG作用于人肝癌细胞(SMMC-7721)48 h后, SMMC-7721细胞细胞周期分布发生了变化，细胞G1期明显增多，从43.6%上升至61.8%，提示EGCG处理后影响了SMMC-7721细胞的细胞周期分布,使细胞受阻于G1期,呈浓度依赖性。流式细胞术检测凋亡得出：30 μg/mL的EGCG诱导细胞凋亡不明显，（P＞0.05 VS control），其它处理组凋亡率均高于对照组（P＜0.05 VS control），随着药物浓度的增加，凋亡率依次增加。本实验结果证实，调控细胞周期,诱导细胞凋亡是EGCG发挥抗人肝癌的作用机制之一。
【】
［１］ Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972,26(4):239～257.
［２］ Crespy V, Williamson G. A review of the health effects of green tea catechins in in vivo animal models. J Nutr, 2004,134(12 Suppl):3 431S～3 440S.
［３］ Tsubono Y, Nishino Y, Komatsu S,et al.Green tea and the risk of gastric cancer in Japan. N Engl J Med,2001,344(9):632～6３６.
［４］ Chung LY, Cheung TC, Kong SK, et al.Induction of apoptosis by green tea catechins in human prostate cancer DU145 cells. Life Sci, 2001,68(10):1 207～１ ２14.
［５］ Landau JM, Wang ZY, Yang GY, et al.Inhibition of spontaneous formation of lung tumors and rhabdomyosarcomas in A/J mice by black and green tea. Carcinogenesis,1998,19(3):501～５０7.
［６］ Shah MA, Schwartz GK. Cell cycle-mediated drug resistance: an emerging concept in cancer therapy. Clin Cancer Res,2001,7(8):2 168～２ 181.
