干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定

                    作者：张国英 刘明社 赵中夫* 张芸 杨慧 武延隽

【摘要】  　　目的：利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA (short hairpin RNA，shRNA)表达的载体，并进行活性鉴定。方法：设计表达短发夹RNA的互补DNA序列，经退火成双链，克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中，构建重组质粒， 转化大肠杆菌DH5α菌株，扩增，提取质粒，酶切鉴定后测序分析。构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞，检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化，确定重组质粒的活性。结果：构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1 和pGenesil-1-siAFP2。酶切鉴定和测序分析，shRNA编码序列与设计的片段完全一致，经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达。结论：成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体。

【关键词】  AFP蛋白　RNAi　shRNA　重组质粒载体

    Abstract  Objective：To construct the recombinant plasmid expressing two AFP-targeted short hairpin RNA (shRNA) with pGenesil-1 plasmids vector, and Detect the Activity of Recombinant Plasmid in HepG2 cells. Methods： Two pairs of DNA sequences were designed and synthesized, and formed complementary chains by annealing respectively. Then the obtained products, siAFP1 and siAFP2, were inserted into plasmid vector pGenesil-1 with U6 promoter. The recombinant plasmids were transforming into the Escherichia coli strain DH5α for screening and amplifying. The sequence analysis of the plasmids and identified by SalI digestion was carried out. The biological activity of recombinant plasmid was detected by transfecting into the HepG2 cell line. Results：The two AFP-targeted shRNAs expressing frame were successfully inserted into the pGensil-1 plasmid vector respectively, and the obtained shRNAs coding sequences were consistent with the designed fragments. The recombinant plasmid inhibited effectively the expression of AFP gene in HepG2 cells.Conclusion： The construction of two recombinant plasmids of AFP-targeted shRNA was successful. Two recombinant plasmids expressing AFP-targeted shRNA inhibited effectively the expression of AFP gene in HepG2 cells.

    Key Words  AFP；RNA interference；Short hairpin RNA；HepG2 cells

    长期以来，人们只是把AFP作为一个肿瘤标志物，用于原发性肝癌(HCC)的诊断指标之一。诸多研究关注于检测甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）对原发性肝癌诊断运用，而对AFP和肿瘤细胞发生及增殖的关系并不完全清楚［１～3］。近年起来的RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术为探索AFP的生物学功能提供了有力的工具。RNAi技术是通过导入细胞19 nt～23 nt的小分子干扰RNA (small interference RNA, siRNA)， 降解同源mRNA，高效、特异性阻断目的基因表达［４～7］。本研究针对人AFP基因设计了2个位点的shRNA表达序列，用人U6启动子和RNA polymeraseⅢ(PolⅢ) 终止信号，构建针对AFP的特异性shRNA真核表达载体，并转染HepG2细胞鉴定活性，探索RNAi技术在沉默AFP基因中的作用。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    质粒载体pGensil-1(含有EGFP，kana r，Neo r表达框架和U6启动子)，Escherichia coli感受态菌株DH5α均由武汉晶赛生物公司提供；质粒抽提试剂盒由中鼎公司提供；DNA连接酶和核酸内切酶：T4 DNA Ligase，SalⅠ，BamHⅠ，HindⅢ以及DL2000 Marker均由美国NEB公司提供；人肝癌细胞HepG2株，由北京大学医学部感染科病毒研究室惠赠；阳离子脂质体METAFECTENE由德国BIONTEX提供。AFP微粒子化学发光免疫分析试剂盒由美国BECKMEN公司提供。

    1.2  方法

    1.2.1  靶向AFP RNAi位点筛选及表达shRNA序列的设计：根据GenBank中人肝癌细胞HepG2细胞AFP基因（gene ID：174）的核苷酸序列，siRNA的设计策略，分别设计两条表达shRNA（65bp）的寡核苷酸序列，siAFP1，siAFP2以及通用阴性对照siHK。经Blast软件查对及序列同源性分析，确定目标基因序列。表达shRNA的寡核苷酸结构：

    以上序列送武汉伯杰生物技术公司合成。

    1.2.2  表达质粒的线性化：pGenesil-1质粒（多克隆位点结构：5’—HindⅢ—Insert_DNA—BamHⅠ—U6_Promotor—EcoRⅠ—SalⅠ—XbaⅠ—DraⅢ—3’）用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，37 ℃酶切8h，10　g/L Agarose凝胶电泳分别回收大片段，即为线性化表达质粒。

    1.2.3  重组质粒的构建、酶切鉴定和测序：分别用annealing buffer 50 μL溶解上述单链寡核苷酸（20 KD）片段。各取2 μL（即siAFP1-A 2μL + siAFP1-B 2μL或siAFP2-A 2μL + siAFP2-B 2 μL）+ annealing buffer 16 μL混匀。94 ℃退火5 min，冷却至室温，得到退火产物siAFP1和siAFP2双链。各取退火产物1 μL加H2O 99 μL稀释100倍。稀释的退火产物siAFP1和siAFP2分别与线性化质粒pGenesil-1用T4 DNA Ligase，10×Ligase Buffer进行连接，22 ℃水浴反应过夜。连接产物分别命名为pGenesil-1-siAFP1和 pGenesil-1-siAFP2。各取过夜连接产物5 μL转化感受态DH5а，分别涂布于含Kana r抗性（终浓度为30 mg/L）的LB平板上，37 ℃恒温箱培养过夜。从每个培养皿上随机挑取3个单菌落接种于3 mL含Kana r抗性（终浓度为30 mg/L）的LB培养液中，37 ℃恒温摇床（250 r/min）培养过夜。用质粒提取试剂盒小量提取质粒，并分别做酶切鉴定：重组质粒 8.5 μL用SalⅠ　0.5 μL，10×L Buffer 1 μL做酶切，37 ℃水浴反应3 h，10 g/L Agarose凝胶电泳鉴定。挑取克隆正确的重组质粒转化菌液去测序。通用阴性对照pGenesil-1-siHK的连接鉴定亦如上述。

    1.2.4  重组质粒活性鉴定：以阳离子脂质体METAFECTENE与重组质粒（pGenesil-1-siAFP1，pGenesil-1-siAFP2或pGenesil-1-siHK）的比例为8 μL∶2.5 μg（预实验的最适比例）分别转染HepG2细胞。24 h后，采用微粒子化学发光免疫分析法（MLFA），检测转染组和对照组的细胞培养上清液中AFP含量，确定shRNA表达载体活性。荧光显微镜检查爬片细胞，计数发荧光细胞占总细胞的比率，确定转染率。

    2  结果

    2.1  重组质粒的酶切鉴定

    因为pGenesil-1-siAFP1、pGenesil-1-siAFP2和pGenesil-1-siHK分别含两个SalI酶切位点，所以重组质粒能够被SalI酶切出包括插入序列（siAFP1、siAFP2或siHK）和U6启动子在内的一条302 bp的DNA片段（见图1，条带2，4，6），表明目的序列siAFP1、 siAFP2和siHK已经分别插入pGenesil-1质粒载体。

    2.2  重组质粒测序分析

    经测序结果分析pGenesil-1-siAFP1,pGenesil-1-siAFP2和pGenesil-1-siHK均为插入正确的克隆质粒，而且质量均符合设计标准。

    2.3  重组质粒的活性鉴定

    重组质粒经脂质体转染HepG2细胞24 h后，在荧光显微镜下，有EGFP报告基因表达蛋白的细胞发绿色荧光，转染率达（52.3±4.3）%（见图2）。 细胞培养上清液的AFP检测：转染pGenesil-1-siAFP1的细胞为(589.02±18.12) μg/mL，转染pGenesil-1-siAFP2细胞为(801.22±20.01) μg/mL，而转染pGenesil-1-siHK的细胞为(938.65±14.29) μg/mL， 方差分析显示三组细胞培养上清液的AFP含量具有显著差异（F=267.64，P＜0.01），pGenesil-1-siAFP1的抑制AFP基因表达的作用胜过 pGenesil-1-siAFP2(t=14.476, P＜0.01)。

    3  讨论

    AFP是胚胎期肝细胞和卵巢黄囊产生的一种蛋白，它是啮齿类动物胚胎期和人胚胎期血清中的主要蛋白成分。早在1944年已有人对甲胎蛋白的存在进行过研究，直到1965年美国家Bergstyandh和Czar才观察到AFP是原发性肝癌患者血清中存在的一种特殊的蛋白成分。认为它不仅在胎儿时期产生，原发性肝癌细胞也大量分泌这种蛋白质。1998年Elena Dudich等通过体外实验研究注意到，AFP对肝癌细胞生长的调节有双相效应性，即低含量的AFP（小于100 μg/mL），特别是当有其他细胞因子存在时，AFP能促进细胞增殖，但大剂量AFP时（大于100 μg/mL），则可诱导细胞凋亡［８］。进一步研究发现，在肝癌细胞膜上有两种不同亲和参数的AFP受体存在，并证明人肝癌Bel7402细胞能分泌AFP，且AFP能作用于细胞膜上的AFP受体，因而认为AFP可能是重要的内源性促肿瘤细胞增殖的自分泌性蛋白质［９］。另有研究表明，AFP对Hela细胞的生长也有促进作用，经使用与AFP分子结构相似的白蛋白（HAS）作对照，结果发现HAS对Hela细胞的增殖、细胞内信号和基因表达均没有影响，而抗AFP单克隆抗体能有效地阻断AFP的这一作用。提示AFP促进Hela细胞增殖具有高度特异性，影响AFP的分泌可能影响肿瘤细胞的增殖和生长［１０］。AFP在原发性肝癌时表达增强，并通过与相应受体结合，对肿瘤细胞的增殖起促进作用。而且阻止AFP 与其相应受体结合及干扰和影响AFP基因表达技术和方法都有可能成为抗原发性肝癌的新的策略。

    有关肿瘤的基因治疗一直是人们普遍关注的研究领域，为干扰和抑制肿瘤细胞的蛋白合成，曾进行过反义RNA、核酶技术、细胞自杀基因导入等方面的实验研究。而近年来发现的RNA干扰技术（RNAi）被认为是最有效基因敲除方法。选择与靶mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使靶mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默,被称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。这种转录后基因沉默与传统的基因敲除技术相比，具有投入少，周期短，操作简单等优势。 Shlomai等［１１］针对靶基因HBV-X，HBV-Core已成功构建了siRNA表达质粒Psuper-x和Psuper-core，使其转染HBV感染细胞，获得显著且特异性地降低X蛋白和核心蛋白的表达水平的结果。Randall［１２］针对靶基因NS5B，体外转录合成21nts的siRNA，转染Huh-7细胞，使HCV-RNA的表达率下降80倍。这些实验研究均为RNAi沉默外源性基因例子。而Jurgen soutschek等［１３］研究证明siRNA也能使内源性基因沉默，他们合成针对apoB的siRNA，能特异性的使apoB蛋白水平下降，从而使血清胆固醇水平下降，同时证实siRNA能使转基因小鼠体内apoB基因沉默。   

    RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能的重要工具［14］。本实验通过构建AFP shRNA载体质粒并成功转染细胞，有效抑制了AFP mRNA的表达，为进一步研究AFP基因在疾病中的作用以及探索肝脏肿瘤的基因治疗奠定基础。

【】
  　　［１］ Masscff CilliJ, krebs B.Evaluation of alpha-fetoprotein(AFP)serum levels during lifespan in man and rat. Ann NY Aca Sci,1975,259(1):17～28.

［２］ 吴雪辉,李穗芬,石亚玲.电化学发光免疫分析法在AFP定量检测中的应用.标记免疫分析与临床，2003,10(4):232～234.

［３］ 章秀兰．用检测甲胎蛋白的定性ELISA试剂作定量测定的尝试．上海医学检验杂志，2002,17(4):154～256.

［４］ Hannon GJ.RNA interference.Nature，2002，418:244～251.

［５］ Donze O, Picard D. RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res，2002：30:e46.

［６］ Yu JY, DeRuiter SL, Turner DL. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA，2002，99:6　047～6　052.

［７］ Miyagishi M, Taira K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat Biotechnol，2002，20:497～500.

［８］ Elena Dudich, Lydia Semenkova, Elena Gorbatova, et al. Growth- Regulative Activity of Human Alpha-Fetoprotein for Different Types of Tumor and Normal Cells［Ｊ］.Tumor Biology，1998,19(1):30～40.

［９］ Uriel J,The physiological role of alpha-fetoprotein in Cell growth and differentiation［Ｊ］. Nucl. Med. Allied Sci,1989,33:12～17.

［１０］ Li MS,Li PF,He SP,et al.Promoting molecular mechanism of alpha-fetoprotein on the growth of human hepatoma Bel 7402 line cells［Ｊ］.World Gastrunal，2002,8(3):467～472.

［１１］ Shlomai A,Shaul Y.Inhibition of hepatitis B virus expression and replication by RNA interference［Ｊ］. Hepatology,2003,37(4):764～770.

［１２］ Randall G, Grakoui A,Rice CM.Clearance of replicating hepatitis C virus replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs，2003,100(1):235～240.

［１３］ Soutschek J,Akinc A.Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modifided siRNAs. Nature，2004，432：173～177.

［１４］ Tusch T.,Zamore P.,Lehmann R.,et al.Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro.［Ｊ］Genes&Dev，1999,13:3　191～3　197.