酸性染料比色法测定苦参药材中总生物碱的含量

【摘要】  　　目的：建立酸性染料比色法测定苦参药材中总生物碱的含量。方法：将苦参的酸水提取液用氢氧化钠溶液调节至中性后，依次加入pH=7.6缓冲溶液，溴代麝香草酚蓝指示液、氯仿混合振摇，静置分层，于413 nm波长处测定氯仿层吸收度。结果：苦参碱检测浓度在0.004mg/mL～0.02 mg／mL范围内与吸收度线性关系良好，平均加样回收率为98.96%(RSD=1.59%)，并对实际药材进行了含量测定。结论：本方法操作简便、准确，可用于苦参药材的质量控制。

【关键词】  酸性染料比色法　苦参碱　含量测定

    Abstract  Objective：To establish a method to determine total alkaloids in radix Sophora lavescens by acid dye colorimetry．Methods：total alkaloids of radix Sophora lavescens were extracted by acidified water，then adjusted to neutral by sodium hydroxide solution, dissolved with buffer solution，then were mixed with 0.025％ of  bromothymol solution and chloroform，and then the mixture was shaken，standing and demixed，the absorbability of chloroform layer was detected at the wavelength of 413nm．Results：The detection concentration of matrine showed good linearity with its absorbability within the range of 0.004 mg/mL～0.20 mg／mL(r=0.9992)，the average recovery was 98.96％(RSD=1.59％)．three radix Sophora lavescens from different source were determined with this method.Conlusion：The established method is simple and accurate，which can be used for quality control of Radix Sophora flavescentis.

    Key words  Acid dye colorimetry；Matrine；Content determination

    中药苦参是豆科植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根，所含有的生物碱是苦参药理作用的主要有效成分，具有抗炎、抗肿瘤、镇痛、抗心律失常、平喘、镇咳、杀菌等作用［１，２］。生物碱含量的多少是评价苦参药材质量好坏的重要指标之一。酸性染料比色法常用于制剂中生物碱的含量测定［３～5］，作者采用酸性染料比色法，以苦参碱为对照品，对不同产地来源的苦参中的总生物碱成分，进行了含量测定，建立了苦参药材中总生物碱含量的测定方法，为苦参药材的质量控制提供了依据。

    1  仪器与试药

    756PL（IV）紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；PHS-4CT型数字酸度计（上海康仪仪器有限公司）。苦参碱标准品（药品生物制品检定所），溴代麝香草酚蓝和其余试剂均为分析纯。

    2  方法与结果

    2.1  对照品溶液的制备

    准确称取苦参碱标准品适量，加50%乙醇制备成浓度为1 mg/mL的对照品溶液，备用。

    2.2  标准曲线的绘制及测定方法

    将“2.1”项下苦参碱对照品溶液稀释至20 μg/mL，各准确量取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，置于干燥的具塞三角瓶中，各加水至5 mL，分别加入pH=7.6缓冲液5 mL,再依次精密加入0.025%溴麝香草酚蓝标准液1.0 mL，氯仿10.0 mL，振摇1 min，倒入50 mL分液漏斗放置分层，静置1 h，分取氯仿层。用分光光度计扫描、测定，结果显示，苦参碱与溴代麝香草酚蓝形成的复合物在413 nm波长处有最大吸收峰，故选择413 nm为测定波长。另以同法操作(不加苦参碱对照品溶液)的氯仿为空白在413 nm波长处测定吸收度。以浓度(C)为横坐标，吸收度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程C=5.362X-0.012(γ=0.9992)，结果表明，苦参碱检测浓度在0.004 mg/mL～0.02mg／mL范围与吸收度线性关系良好。

    2.3  稳定性实验

    取20.0 μg/mL对照品溶液3.0 mL 按2.2 方法制备标准品供试液和空白对照液，在波长413 nm 处进行测定。并在室温下每隔1 h测定1次含量，连续测定8次，结果表明，待测液在8 h内稳定，其RSD=0.47% (n=8) 。

    2.4  精密度实验

    取20.0 μg/mL标准对照液3.0 mL，按2.2 下方法制备标准品供试液和空白对照液，在413 nm 波长处测定，重复测定5次。结果RSD=0.23%。

    2.5  加样回收实验

    精密称取已知总生物碱含量的苦参药材5份，每份约0.08 g，分别准确加入28.5 μg/mL苦参碱对照液1.6 mL，按2.2项制备样品供试液和空白对照液，在波长413 nm处测定。结果样品的平均回收率为98.96 %，RSD=1.59%(n=5)。

    表1  中药材苦参含量测定结果

    批次产地总生物碱含量(mg/g)1河北安国1.03  2安徽亳州2.26  3山西长治1.89

    2.6  苦参总生物碱的含量测定

    　      将三种不同产地来源的苦参药材粉碎后，分别精密称取干燥至恒重的通过60目筛的生药粉0.1550 g ,加0.1%盐酸10 mL,冷浸4 h后，超声提取1 h，滤过，滤液用1 mol/L氢氧化钠溶液调节至中性，取调节至中性的滤液5.0 mL置分液漏斗中，依次精密加入pH=7.6缓冲溶液5 mL、0.025%溴麝香草酚蓝标准液1.0 mL，氯仿10.0 mL，振摇1 min，放置分层，静置1 h，分取氯仿层。在413 nm波长处，以不加药材，同法操作的氯仿为空白，测定吸光度。将测得的吸光度值代入标准曲线可以求得苦参药材中生物碱的含量。

    3  讨论

    3.1  由于苦参药材含有的生物碱成分都易溶于酸水溶液，因此在药材含量测定中采用0.1%盐酸作为提取液，冷浸结合超声提取的方法，可以保证生物碱成分的提取完全。

    3.2  本实验采用酸性染料比色法，是根据在一定pH介质中，生物碱类与氢离子生成阳离子，一些酸性染料在此条件下可解离成阴离子而与上述阳离子定量结合成有色络合物，可被有机溶剂定量提取的原理，用苦参碱作为标准物质在pH=7.60的条件下与溴麝香草酚蓝定量显色，苦参药材中的生物碱在此条件下凡能与溴麝香草酚蓝显色的均可被测出，从而求得相对总生物碱的含量。该法灵敏度高，结果稳定，操作简便，易于在生产单位，药材经营等基层单位推广应用，用于苦参药材的质量控制。

    3.3  溴麝香草酚蓝溶液浓度的选择，取溴麝香草酚蓝配制成0.010%、0.025%、0.050%、0.075%、0.100% 5个不同浓度的溶液，取1.0 mL 溴麝香草酚蓝显色剂，按2.2项下方法进行测量，结果表明显色剂的浓度对测定结果有干扰。在保证测定样品中苦参碱完全与显色剂结合的前提下，经筛选试验，最佳显色条件应为0.025%的溴麝香草酚蓝标准液加1 mL进行显色。

    3.4.  在实验对新鲜配制和放置1个月的显色剂对结果的影响进行了考察。样品按2.2项下方法分别加入两种显色剂进行测量，结果显示放置1 个月的显色剂的测量结果明显偏小，说明显色剂放置一段时间后不稳定。所以，试验所用显色剂应在使用时新鲜配制。

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  　　［１］ 李广勋．中药药理与临床［Ｍ］．第1版，天津：科技翻译出版公司，1992：63～64.

［２］ 李金陵，程爱民，荆宇红，等．重要苦参抗肿瘤作用的实验研究［J］．肿瘤临床与康复，2002，9（2）：28～29．

［３］ 仵文英，刘 硕，张抗怀，等．酸性染料比色法测定苦参碱脂质体中苦参碱的含量［Ｊ］.中国药房，2005，16（22）：1　734～1　735．

［４］ 朱治富，李国元，赵 成，等．酸性染料比色法测定乌贝散中浙贝总生物碱的含量［Ｊ］.安徽医药，2003，7 (3)：222．

［５］ 刘 萍，辛 勋，马 汉．离子对比色法测定元胡止痛片中总生物碱的含量［Ｊ］.湖北医科大学学报，2000，21（3）：196～198．