电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化

                作者：单铁英 苏安英 唐军民

【摘要】  目的：通过电穿孔法将带有增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced green fluorescent protein EGFP）的真核表达载体pIRES2-EGFP（IRES2 internal ribosome entrysite 2内部核糖体进入位点2）质粒导入未成熟树突状细胞（Immature Dendritic Cell,imDC），探讨不同电穿孔条件对imDC电转染率和存活率的影响。方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞，采用细胞因子体外培养诱导其成为imDC。在大肠杆菌中扩增pIRES2-EGFP质粒，选择不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、DNA剂量等。应用电穿孔仪将pIRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞，荧光显微镜下和光镜下分别绿色荧光阳性细胞数和总细胞数。0.4%锥虫蓝(trypan blue)染色，计数电转染后细胞存活率。结果：当imDC浓度为5×106/mL与6 μg DNA质粒混合,设定电转染仪电压为300 V、脉冲时间为500 μs时,其电转染率到最高,细胞存活率最高，转染后24 h明显表达，48 h后表达最强。结论：在适当的电压、脉冲时间下，选择适当的细胞浓度、DNA剂量，在转染后的一定时间范围内，电穿孔法转染imDC可使目的基因获得较高的转染率，且细胞死亡最少。电转染提供了外源基因转染imDC的可行技术。

【关键词】  电穿孔 转染 绿色荧光蛋白 树突状细胞

    Abstract  Objective:pIRES2-EGFP was successfully transfacted into immature dendritic cells by means of electroporation in order to investigate the effect of electransfection efficiency and survival rate of immature dendritic cells in different conditions.Methods:Monocytes obtained form human peripheral blood by density guadient centrifugation are induced into imDCs in the presence of cytokines in vitro.pIRES2-EGFP was amplified in E.coli.imDCs were transferred with pIRES2-EGFP by means of electroporation with different electric voltages,times of impulse,cell concentrationsand the doses of DNA.Numbers of green fluorescence positive cells and the total cell number were counted respectively under fluorescent microscope and visible light microscope.the cells were stained with 0.4% trypan blue,electransfection efficiency and the cell survival rate were counted.Results:Electransfection efficiency was increased to the highest value when imDCs with the concentration of 5×106 cells/mL were mixed with 60 μg-total DNA,the electric voltage of electroporation apparatus was set at 300 V,and the time of impulse was 500 μs.There was significant and the highest expression of pIRES2-EGFP respectively at 24 h and at 48 h after transferring.Conclusion:A higher transfection efficiency of target genes can be obtained by means of electroporation with suitable electric conditions.Electric transfection provides a technical possibility to make DNA into imDCs.

    Key words  Electroporation;Transfect;Green fluorescent protein;Dendritic cell;Human

    树突状细胞（dendritic cell,DCs）作为体内惟一能活化初始T细胞的抗原递呈细胞（antigen presentingcell,APC)，是激发机体特异性免疫反应的关键，其在抗肿瘤免疫领域中的作用受到广泛关注，以DCs为基础构建的各种类型的疫苗在多种肿瘤免疫治疗的基础和临床研究中显示了旺盛的生命力和良好的前景［１，２］。本研究应用电穿孔仪将pIRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞，探索外源基因转染imDC的优化条件。

    1  材料与方法

    1.1  材料与器材

    pIRES2-EGFP质粒（Clontech公司）、Wizard质粒抽提试剂盒( Promega公司),HincⅡ酶(Takara公司)。健康人新鲜外周血，购自北京市血库。RPMI-1640培养液，美国GIB公司产品。淋巴细胞分离液（Ficoll，1.077 g/mL），上海试剂二厂产品。胎牛血清（FCS），新生牛血清(NCS)，美国HYClone公司产品。重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和重组人白细胞介素4（rhIL-4），肿瘤细胞坏死因子a（TNF-a）、购自德国R&D公司产品。电转染仪BTX-830，购自北京基因公司。

    1.2  质粒的制备及鉴定

    将pIRES2-EGFP质粒转化感受态TOP10大肠杆菌,取菌液20 μL接种到5 mL含100 μg/mL卡那霉素的LB培养基中。在37 ℃摇床上剧烈震荡培养过夜。按照Wizard质粒抽提试剂盒说明书用碱裂解法提取、纯化质粒DNA，紫外分光光度测OD260 nm∶OD280 nm=1.8，证明质粒纯。测浓度为0.4 μg/μL，保存于-20 ℃备用。取少量质粒用HincⅡ酶切，0.9%琼脂糖电泳鉴定酶切结果，验证该质粒是否确为pIRES2-EGFP。

    1.3  imDC的获取

    取正常人新鲜外周血200 mL，以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMNC），在37 ℃和5%CO2饱和湿度条件下培养2 h，取贴壁细胞即单核细胞（pDC），并测其纯度，调整细胞浓度为2×106/mL加入RPMI-1640液、10%胎牛血清（FCS）和细胞因子rhGM-CSF(1 000 U/mL)；(rhIL-4)500 U/mL于37 ℃和5%CO2饱和湿度条件下培养。第7 d收获的细胞为imDC，用免疫细胞化学的方法显示细胞表面共刺激分子CD80、CD86及HLA-DR，计数阳性细胞。

    1.4  电穿孔法转染树突状细胞

    1.4.1  不同电压条件下转染imDC：根据北京基因公司提供参数及操作程序将pIRES2-EGFP质粒转入imDC，选择脉冲时间下400 μs，细胞浓度1×106/mL、DNA剂量2 μg不变，电压分别为200 V、300 V、400 V条件下进行瞬间和稳定电转染。电穿孔缓冲液为RPMI-1640培养液；电转杯体积0.8 mL，将0.4 mL细胞悬液与pIRES2-EGFP质粒混合均匀进行电转染，电穿孔后30 min加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养，同时以未转染的imDC为空白对照。

    1.4.2  不同脉冲时间下转染imDC：选择电压为300 V，细胞浓度1×106/mL、DNA剂量2 μg不变，脉冲时间400 μs、500 μs、600 μs条件下进行瞬间和稳定电转染。其余操作同前。

    1.4.3  不同DNA剂量下转染imDC：选择电压为300 V，细胞浓度1×106/mL、脉冲时间500 μs不变，DNA剂量分别为4 μg、6 μg、8 μg条件下进行瞬间和稳定电转染。其余操作同前。

    1.4.4  不同imDC浓度下进行转染：选择电压为300 V、DNA剂量为6 μg、脉冲时间500 μs不变，细胞浓度分别为1×106/mL、5×106/mL、8×106/mL条件下进行瞬间和稳定电转染。其余操作同前。

    1.4.5  电转染率观察及存活率观察：电转染后，细胞涂片在荧光显微镜的可见光下固定1个视野，计数细胞总数，然后转换荧光光源，计数发出绿色荧光的细胞,计算电转染率。

    电转染率=(发出绿色荧光的细胞数/可见光下总细胞数)×100

    于电穿孔后，0.4%锥虫蓝(trypan blue)染色，计数电转染后细胞存活率。

    2  结果

    2.1  pDC纯度及imDC阳性率：pDC的纯度为90%，imDC的阳性率为80%。

    2.2  免疫荧光显微镜下显示电转染后imDC细胞内GFP荧光（见图1）。

    2.3  用荧光显微镜观察不同的电压pIRES2-EGFP质粒在imDC中的表达率及细胞存活率，见表1。随着电压的升高，表达率增强，以300 V时最强，超过300 V后表达率有所下降。细胞存活率在48 h时超过70%，点随着电压的升高和时间的延长，imDC死亡率升高。表1  不同电压时不同时间pIRES2-EGFP质粒在imDC的表达率

    2.4  用荧光显微镜观察不同的脉冲时间pIRES2-EGFP质粒在imDC中的表达率，见表2。随着脉冲时间的延长，表达率增强，以500 μs时最强，超过500 μs后表达率有所下降。细胞存活率在48 h时超过70%，点随着电压的升高和时间的延长，imDC死亡率升高。表2  不同的脉冲时间时不同时间pIRES2-EGFP质粒在imDC的表达率

    2.5  用荧光显微镜观察不同的DNA剂量pIRES2-EGFP质粒在imDC中的表达率，见表3。质粒DNA剂量的变化不影响细胞的存活率。表3  不同的DNA剂量时不同时间pIRES2-EGFP质粒在imDC的表达率

    2.6  用荧光显微镜观察不同的细胞浓度pIRES2-EGFP质粒在imDC中的表达率，见表4。随着细胞浓度的增加，表达率增强，以5×106/mL时最强，超过5×106/mL后表达率有所下降。细胞存活率在48 h时超过70%，细胞浓度的变化不影响细胞的存活率。表4  不同的细胞浓度时不同时间pIRES2-EGFP质粒在imDC的表达率

    3  讨论

    基因转染技术是近年来常应用的分子生物学技术，它是利用各种转染方法将目的基因转入细胞，以研究目的基因对细胞生物学行为及功能的影响。通常的质粒转染方法有磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体法、逆转入病毒介导转染方法、电穿孔法等。在这几种方法中，电穿孔法是实验室中获得较高转染率的一个较为理想的方法［３］。电穿孔技术最早用于基因转染，现广泛用于多种分子的传递，如：离子、药物、示踪剂、抗体、寡核苷酸、DNA、RNA等［４］。它通过将细胞暴露在短暂的高压强脉冲下转导分子，将细胞悬浮液置于电场中诱导细胞膜上的电压差产生，从而导致细胞膜上形成暂时的、可逆的孔道，各种转导的分子可通过简单扩散或胞饮作用进入细胞，整合到细胞基因组并随着细胞基因组的复制而复制。

    在实验中，我们选择了电转染作为转染方式，其特点为：①电转染为一种纯物理方法，因此可避免化学性的和生物性的毒性。②应用范围广，可适用于各种类型的细胞［５～6］。③实验证明，其转染率较高［７～8］。④电转染会对imDC造成一定的损伤，如：细胞融合、细胞死亡等，但是绝大多数细胞可恢复到正常状态。⑤电转染不改变imDC原有蛋白的表达。

    通过我们的实验证明不同的电压、不同的脉冲时间下，pIRES2-EGFP质粒在imDC的表达率不同，其中以电压为300 V、脉冲时间500 μs时表达率最高，随着电压的升高，脉冲时间的延长，细胞的表达率下降，转染后48 h细胞存活率超过70%，部分细胞开始贴壁生长，但随着时间的延长，imDC死亡率升高。DNA剂量不影响细胞的存活率，但可使pIRES2-EGFP质粒在imDC的表达率不同,随着DNA剂量的增加，表达率增强，但超过6 μg后表达率并无明显增加。我们认为，质粒DNA转染细胞时，细胞吸收DNA有一定的饱和性，当超过饱和程度时，增加DNA剂量，转染率不再提高。

    在电压为300 V、DNA剂量为6 μg、脉冲时间500 μs、细胞浓度分别为5×106/mL优化条件下进行电转染4 h，EGFP没有表达，12 h后有少量表达，24 h后表达增强，48 h荧光表达最强，72 h后荧光减弱。这可能与GFP的表达量有关，也可能与细胞的生长有关。这与Rohr［9］等的报道接近。

    总之,电转染法具有其他方法无法比拟的优越性,其可重复性强、简便、快速、高效及适应于多种细胞系等优点。我们建立了一套快速优化、可的电转染参数,对细胞体较大、细胞膜结构形态不一,较难电转染的树突状细胞亦可取得较高的电转染率。

【参考文献】
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［２］ Gitlitz BJ,Belldegrun AS,Zisman A,et al.A pilot trial of tumorlysate-loaded dendritic cells for the treatment of metastatic renal cell carcinoma.J Immunot her,2003,26(5):412～419.

［３］ Baum C,Forster p,Hegewisch Beckers,et al.An optimized electroporation protocol applicable to a wide range of cell lines［Ｊ］.Biotechniques,1994,17(6):1　058～1　062.

［４］ Gehl J.Electroporation:theory and methods,perspectives for drug delivery,gene therapy and rsearch［Ｊ］.Acta Physiologica Scandinavica,2003,177(4):437～447.

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［８］ Paglia P,Girolomoni G,Robbiati F,et al.Immortalized dendritic cell line fully competent in antigen presentation initiates primary T cell responses in vivo.J Exp Med,1993,178(6):1　893～1　901.

［９］ Rohr UP,Ralf K,Dirk G,et al.Primary human cells differ in their susceptibility to rAAV-2-mediated gene transfer and duration of reporter gene expression［Ｊ］.J Viro Met,2002,105(2):265～275.