低频超声联合微泡剂对血管内皮 细胞的生物学效应
[关键词]低频超声；微泡剂；细胞凋亡；VEC304
超声可通过空化效应与热效应不同的起始途径诱导细胞凋亡等细胞损伤[1-3]，低频超声联合微泡剂可增强超声对细胞的杀伤效应[4]。本研究以体外培养的人脐静脉血管内皮细胞VEC304为研究对象,应用MTT法、 流式细胞仪（FCM）检测及分光光度法,初步探讨低频超声联合微泡剂对血管内皮细胞的生物学效应及其可能的机理。
1 材料与方法
1.1 细胞及培养 人脐静脉血管内皮细胞VEC304由细胞银行提供, 用RPMI 1640(购自GIBCO )培养基培养,该培养基含10%胎牛血清（四季青公司生产）、 100 U・ml-1 青霉素和100 mg・ml-1 链霉素, 在37℃、5% CO2 培养箱中培养。
1.2 主要仪器及微泡剂 利用东南大学江苏铁医美达康医疗设备厂生产的NTY300型多功能超声手术装置(简称NTY装置，20kHz，输出功率0～30.0W)进行离体实验，超声探头直径2 cm； 微泡剂由5％碳酸氢钠、 维生素C和胶体按一定比例配制而成。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞分组 将细胞分为空白对照（A）组，无任何干预措施；单纯微泡剂（B）组，单纯加入微泡剂；单纯超声（C）组，因给予不同时间的超声辐照又分为 C1组(60 s)、C2 组 (90 s)、C3组 (120 s)和C4 组 (150 s）；超声联合微泡剂（D）组，因加入微泡剂后立即给予不同时间的超声辐照又分为 D1组 （60 s）、D2组 (90 s)、D3组 (120 s)和D4组 (150 s）。
1.3.2 步骤（1） MTT法检测细胞存活率： 用0.25%胰酶消化细胞成单细胞悬液并调整浓度为2×104ml-1，吸200 μl加入96孔板，按上述分组方法将每块板设立A、B、C 和D组，每组置3个复孔。C、D组因有4个不同的超声辐照时间，故C、D组分别接种12个孔的细胞。每次同时接种3块板，接种后放入培养箱孵育待其贴壁后给予不同的处理，然后继续放入培养箱孵育。分别于处理后1、24、48h取出1块96孔板作MTT检测。在570 nm波长下测定吸光值Ａ570。应用公式细胞存活率＝OD值实验组/ OD值空白对照组×100% 细胞存活率。(2) 活性氧（ROS）及超氧化物歧化酶（SOD）的检测：ROS及SOD试剂盒购于南京建成生物工程研究所。检测操作步骤按说明书，计算方法根据标准品ＯＤ值绘制标准曲线,从标准曲线上查出待检标本中ROS及SOD的含量,结果以U・ｍl-1表示。ROS活力（U・ｍl-1）＝(Ａ测定管－Ａ对照管)／（Ａ标准管－Ａ标准空白管）×标准管浓度（8.824 mmol・L-1）×1 ml／取样量×样本测试前的稀释倍数。SOD活性（U・ｍl-1）＝(Ａ测定管－Ａ对照管)／Ａ标准管×2×反应液总量／所取样品量。（3） FCM检测细胞凋亡：处理后的VEC304细胞继续培养24h后用0.25%胰酶消化细胞成单细胞悬液并调整浓度为106ml-1 ，取细胞离心,PBS洗涤，送流式细胞检测中心用AnnexinⅤ检测凋亡率，并将正常的VEC304作为对照组。
1.4 统计学方法 本实验结果数据以x-±s表示。采用SPSS 13.0软件进行统计处理,Ｐ＜0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 MTT法检测细胞存活率实验中观察到单纯微泡剂对细胞无明显杀伤效应，细胞存活率均在98%以上，与对照组相比差异无显著意义(P＞0.05)。处理后细胞孵育24h的存活率分别为：C1组 (89±3.5）% 、C2组 (85±5.5)%、C3组 ( 71±6.4)%、 C4组 ( 79±7.2)%、 D1组 (88±3.2)%、 D2组 ( 82±4.7)% 、D3组 (49±4.2)%和D4组 ( 57±3.0)%。从以上结果看出,在4个不同的辐照时间中以辐照120 s的细胞，即C3 、D3组细胞存活率最低，与对照组相比差异有极显著意义(P＜0.01)，且D组杀伤效应明显高于C组(P＜0.01)。在3个不同的辐照后培养时间中以第24小时细胞存活率最低，见表1。以上结果提示超声辐照能够使细胞增殖受到抑制，以辐照120 s、培养24h后作用最为显著且微泡剂可增加细胞抑制的程度。故FCM检测以超声辐照120 s、孵育24 h 作为实验参数，ROS、SOD检测以辐照120 s作为实验参数。
2.2 ROS和SOD活力的测定结果 A、B、C3和D3组细胞分别于处理后0、60和90 min检测ROS、SOD活力，结果见表2、3。表1 辐照120s培养不同时间后细胞存活率表2 处理后孵育不同时间的细胞培养液中ROS活力 表2结果提示超声辐照能够使细胞培养液中ROS的活力增加，并且微泡剂可增强这种作用。表3 处理后孵育不同时间细胞培养液中SOD 活力 表3结果提示超声辐照能够使细胞培养液中SOD的活力降低，并且微泡剂可增强这种作用。
2.3 ＦＣＭ检测结果为了进一步探讨细胞增殖抑制是否与细胞凋亡有关,作者用ＦＣＭ检测了细胞凋亡率，检测结果A组为（1.15±0.37）%， B组为 （2.39±0.65）%，C3组为（11.7±2.68）%，D3组为（21.15±4.68）%。A、B组细胞凋亡率无显著差异(P＞0.05)，C、D组凋亡率较A组明显增加(P＜0.01)，D组较C组凋亡更为显著(P＜0.01)。以上结果提示超声辐照能够诱导VEC304细胞凋亡，微泡剂可明显增强超声诱导凋亡的作用。
3 讨 论
通过控制肿瘤血管形成的抗血管生成是肿瘤治疗的热点[5]。目前主要应用化学药物，如内皮抑制素endostatin、VEGF受体抗体和酪氨酸激酶抑制剂 Genistein等治疗。物理方法如低频超声抑制肿瘤血管形成、诱导细胞凋亡的应用是肿瘤治疗的新进展。本实验中观察到低频超声联合微泡剂对体外培养的血管内皮细胞具有明显的抑制增殖和促进凋亡的作用，存活率最低的为（49±4.2）%，凋亡率最高的为（21.15±4.68）%，与Sergeeva等 [6]的实验结果一致。同时我们在实验中观察到D组作用明显高于C组，证实了Simon 等[4]的微泡剂可以增强低频超声杀伤细胞作用的理论。本实验中C组和D组细胞培养液中ROS明显增加，证实了低频超声产生的效应主要与空化作用产生ROS自由基有关[7]的理论。同时我们还检测到C组和D组细胞培养液中SOD降低较显著，这可能是低频超声通过空化作用产生了大量ROS的同时也使SOD这一自由基清除剂的浓度降低，从而使ROS的产生远远超过它的清除，导致高浓度的ROS在细胞外积聚，产生细胞损伤和诱导细胞凋亡。国内外多个实验结果证实超声联合微泡剂可诱发辐照部位的血栓形成[813]。本实验中D组细胞凋亡明显，据此我们推测，应用低频超声联合微泡剂治疗实体瘤时会使受照射部位血管内皮细胞损伤和凋亡而形成血栓，导致该处缺血缺氧使肿瘤细胞损伤和坏死而达到治疗目的。低频超声联合微泡剂作为一种新的肿瘤治疗方法，其应用前景广泛，但其真正的机制还需进一步研究。
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