早期宫颈癌耐药基因与临床预后关系回顾性研究
作者：张凡 常永霞 张九鸿 成日青 赵秀芳
【摘要】目的:探讨耐药基因p糖蛋白（pgp）、谷胱甘肽s转移酶（GSTπ）、拓扑异构酶Ⅱ（TOpoⅡ）、胸苷酸合成酶（TS）在宫颈癌中的表达及临床意义。方法:应用免疫组织化学方法检测65例宫颈癌中pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS的表达，并分析其与临床预后之间的关系。结果:pgp的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移有关（P<005），与UICC分期、局部复发无关（P>005）；TOpoⅡ的表达与淋巴结转移、局部复发有关（P<005），与肿瘤分化程度、UICC分期无关（P>005）；GSTπ的表达与各个指标之间均存在相关（P<005）；TS与淋巴结转移、UICC分期有关（P<005），与局部复发、肿瘤分化无关（P>005）。经多因素cox比例风险模型分析显示：局部复发、淋巴结转移及TOPOⅡ、GSTπ的表达与宫颈癌患者术后生存率有关（P<005）。结论:宫颈癌中pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS的联合检测对判断宫颈癌的预后十分必要；局部复发、淋巴结转移及TOpoⅡ、GSTπ的表达可作为宫颈癌患者独立的预后因素。【关键词】宫颈癌；多药耐药；免疫组织化学；预后
【ABSTRACT】Objective:To investigate the expression of pglycoprotein(pgp)、glutathionestransferaseπ(GSTπ)、topoisomerase Ⅱ(TOpoⅡ) and thymidylate synthase(TS)and their clinical significance in Cervical Carcinoma.Methods:The expressions of pgp、 TOpoⅡ、GSTπ、TS proteins were detected by immmunohistochemistry method in sixtyfive patients with Cervical Carcinoma who were followed up more than ten years.The relationship between the expression of antidrug proteins and clinical prognosis were analysed.Results:The expression of pgp was associated with lymph node metastasis and histological grading (P<005)，but not related with partial recurrence and UICC staging(P>005); The expression of TOpoⅡ was associated with lymph node metastasis and partial recurrence (P<005)，and not associated with histological grading and UICC staging(P>005);The expression of GSTπwas associated with all parameters (P<005); The expression of TS was associated with lymph node metastasis and UICC grading (P<005)，but had no relationship with partial recurrence and histological staging(P>005); After multivariate Cox analysis, survival rate was correlated with partial recurrence, lymph node metastasis and expressions of TOPOⅡand GSTπ(P<005) and for the operated patierts. Conclution:The detection of the drug resistance genes: TOpoⅡ and GSTπ has important clinical significence for the selection of chemotherapy regimen；partial recurrence, lymph node metastasis and the expression of GSTπand TOpoⅡ can be regarded as independent prognostic factors in cervical carcinoma.
【KEY WORDS】Cervical carcinoma;Multidrug resistance;Immunohistochemistry; Prognosis
目前研究表明肿瘤耐药机制主要有以下几个方面：一是肿瘤细胞内多药耐药基因（MDR1）及其表达产物p糖蛋白（pgp）介导的多药耐药现象，称为典型多药耐药；二是由拓扑异构酶Ⅱ（TOpoⅡ）介导的，称为非典型多药耐药；三是谷胱甘肽s转移酶（GSTπ）的表达；四是胸苷酸合成酶（TS）的表达[1~3]。宫颈癌是目前危害女性健康的常见肿瘤，发病年龄趋于年轻化，手段主要是手术治疗。晚期宫颈癌主要以放射治疗为首选，因此有关宫颈癌耐药基因的研究报道较少。本研究利用免疫组织化学方法探讨宫颈癌中pgp、GSTπ、TOpoⅡ、TS耐药基因蛋白的表达与肿瘤的临床病理特征、术后生存之间的关系，旨在为今后临床宫颈癌患者预后的判断提供可靠的理论依据。
2006年2月张凡等：早期宫颈癌耐药基因与临床预后关系回顾性研究第1期2006年2月河北北方学院学报（医学版）第1期
1资料与方法
11一般资料
收集我院19851~199512月住院患者中临床病理资料齐全，并有10年以上随访结果的宫颈癌患者65例（随访时间至2004年1月，死亡病例均死于宫颈癌相关病变），所有病例均为原发早期宫颈鳞状细胞癌，都进行了宫颈癌手术治疗，未作术后化疗、放疗等辅助治疗；年龄25~69岁，平均年龄51岁；无淋巴结转移21例，淋巴结转移44例；无局部复发42例，局部复发23例；按照M分期标准进行临床分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期40例。资深病理医师对切片进行复习确诊，其中高分化8例，中分化39例，低分化18例。
12免疫组织化学染色
所有标本经10%甲醛常规固定,石蜡包埋,4μm连续切片。pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS一抗试剂均购自北京中山试剂公司；主要免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗（采用专用微波炉进行抗原微波热修复），正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗、三抗各1h，DAB显色10~15min，苏木素复染脱水透明，中性树胶封片。
结果判断:着色细胞<10%为阴性,>10%为阳性。pgp阳性表达定位在肿瘤细胞膜和细胞质，TOpoⅡ阳性表达定位在细胞核，GSTπ阳性物质定位在细胞质和细胞核，TS阳性物质定位在细胞质。采用HIPAS100图象分析软件对所有切片进行图象分析，每张切片随机选取5个着色典型区域且不重复的视场，测量每个视场中阳性单位，取其均数即为该切片的着色强度，所有的结果都以均数±标准差表示。
13统计学方法
应用SPSS100统计软件进行统计学处理。不同组间表达率的比较采用Fisher精确概率法，各指标表达水平与临床病理参数之间作直线回归相关分析，对全部病例用cox比例风险模型进行单因素和多因素生存分析，并对有预后价值的指标作KaplanMeier生存曲线。以α=005作为具有统计学意义。
2结果
65例宫颈癌病例中，pgp阳性40例（615%），TOpoⅡ阳性28例（430%）、GSTπ阳性35例（538%），TS阳性18例（276%）。GSTπ在高中分化癌中的阳性表达率明显低于在低分化癌中的表达率，在无淋巴结转移组的阳性表达率明显低于淋巴结转移组，Ⅰ期的阳性表达率明显低于Ⅱ期，无复发组的阳性表达率低于复发组的阳性表达率。TS在无淋巴结转移组的阳性表达率明显低于淋巴结转移组的表达率；TOpoⅡ在复发组中的表达率明显低于在无复发组中的表达率（见表1）。
各指标的着色强度与肿瘤的各临床病理参数之间做直线回归相关分析显示：pgp的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移有关（P<005），与局部复发及UICC分期无关；TOpoⅡ的表达与局部复发、淋巴结转移有关（P<005），与肿瘤分化程度、UICC分期无关（P>005）；GSTπ的表达与各个指标之间均存在相关（P<005）；TS的表达与淋巴结转移、UICC分期有关（P<005），与肿瘤分化程度、局部复发无关（P>005）（见表2）。
临床病理特征、耐药基因蛋白表达与术后生存之间的关系（见表3）对随访资料进行单因素Cox模型分析，结果显示：宫颈癌分化程度、淋巴结转移、UICC分期及TOpoⅡ、GSTπ的表达均与术后生存之间明显相关（ P<001），TOpoⅡ与术后生存之间存在明显负相关（见表4）。多因素Cox模型分析结果显示：只有局部复发、淋巴结转移、TOpoⅡ和GSTπ的表达与术后生存时间之间存在明显相关（P<005），即出现局部复发、淋巴结转移、TOpoⅡ低水平表达和GSTπ表达水平越高，患者的术后生存时间越短，生存率越低（见表5及图1~图4）。
3讨论
肿瘤耐药是其在适应抗癌药物的微环境生存中的重要的机制，分为原发耐药和继发耐药，前者是肿瘤细胞的内在性耐药，发生于化疗后的耐药称为获得性耐药。另外肿瘤细胞对一种药物产生耐药后可能对与这种药物结构和作用机制完全不同的其它药物产生耐表1pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS在各组中表达阳性率比较表2pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS表达与临床病理参数相关分析表3临床病理特征、耐药基因蛋白表达与术后生存之间关系
临床病理特征例数生存小于60个月例数生存60~120个月例数生存大于120个月例数组织类型高分化8332中分化3920127低分化181053淋巴结转移无转移215124有转移4419187复发无复发4282410复发231283UICC分期Ⅰ期254156Ⅱ期4015187耐药基因GSTπ阳性3515146GSTπ阴性309129TOpoⅡ阳性288911TOpoⅡ阴性37121510pgp阳性2510105pgp阴性40122010TS阳性181053TS阴性47151715表4宫颈癌术后生存单因素分析（cox比例风险模型）表5宫颈癌多因素生存分析（cox比例风险模型）结果药，此即多药耐药（multidrug resistance，MDR），常常导致联合化疗方案的失败。目前已经发现的耐药谱明确的耐药基因共有11种，可分为药泵蛋白、药物代谢酶类、DNA修复酶、蛋白质合成限速酶等。已有显示早期宫颈癌的预后良好，Ⅰ期患者术后五年生存率为100%，Ⅱ期术后五年生存率为85%，然而调查发现早期宫颈癌患者术后生存差别很大，对其进行的耐药基因的免疫组织化学染色结果提示肿瘤细胞耐药基因表达差别明显。本次实验对耐药基因和术后生存之间的关系进行研究，旨在探讨耐药发生机制，并寻找对临床预后具有意义的关键指标。
目前公认最主要的多药耐药基因是MDR1的过度表达[4]。人类肿瘤的多药耐药基因家族由MDR1和MDR3组成，仅MDR1表达与肿瘤耐药性有关[5，6]。MDR1是编码分子量为170KD的细胞膜糖蛋白，命名为p糖蛋白（pglycoprotein，pgp），又称p170，其功能为能量依赖性跨膜外排泵，使细胞内药物蓄积减少，从而使细胞对药物耐药，同时对不同的亲脂类药物产生交叉耐药。已有的研究表明MDR1在宫颈癌、肾细胞癌、肝细胞癌中通常高水平表达，而乳腺癌、卵巢癌中出现低水平表达。Weinstein等研究显示pgp阳性表达的结肠癌易于浸润血管和淋巴结转移[7]。Winaler等对随访的112例宫颈癌患者进行研究后发现：pgp阳性患者术后5年生存率显著低于pgp阴性患者[8]。我们的实验结果显示：早期宫颈癌pgp阳性率615%，阳性区域呈现弥散分布特点。在各组间的阳性表达率之间无明显差别。其表达水平较高，且表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移呈明显正相关，与肿瘤局部复发、UICC分期无明显相关性，并且经单因素和多因素cox比例风险模型分析该指标对早期宫颈癌预后无意义。因此我们认为pgp对宫颈癌的淋巴结转移与否具有监测意义，但不能作为早期宫颈癌预后的独立指标。
GSTπ是一组多功能药物代谢酶，与细胞内解毒密切相关，临床应用的许多抗肿瘤药物都可在GST的催化下通过谷胱甘肽（GSH）结合而解毒。GST根据等电点的不同分为碱性、中性和酸性三种。其中酸性GST（GSTπ）是肿瘤细胞和组织中最常见的同功酶，在许多耐药细胞尤其是MDR阳性表型的细胞中高表达。GSTπ主要分布于消化道、泌尿系统和呼吸道上皮。在结肠上皮、腺瘤、结肠癌和患者血清中都可检测到GSTπ，而且其表达水平与临床分期（TNM）呈正相关；Waster等研究显示：GSTπ基因的启动子可上调VEGF的表达[9,10]。我们的实验显示：GSTπ阳性率为538%，阳性区域呈弥散分布，其表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移、局部复发、UICC分期都呈正相关，且阳性患者的术后生存时间明显短于阴性患者，因此推测该耐药基因的高表达不仅预示肿瘤耐药性的获得，同时肿瘤诱导宿主血管长入瘤体，使肿瘤恶性程度增加，更具侵袭和转移特性；单因素和多因素Cox比例风险模型分析显示，GSTπ表达可作为宫颈癌患者一项独立的预后指标，因此早期宫颈癌GSTπ的阳性表达预示预后不良。
DNA拓扑异构酶Ⅱ是一种能将DNA由一种拓扑异构体变为另一种拓扑异构体的酶，是真核细胞不可缺少的一种重要核酶，参与基因重组、转录和DNA修复等[11,12]。Dranks等首先发现DNA拓扑异构酶Ⅱ与耐药有关，TOpoⅡ介导的耐药性的基础即在于TOpoⅡ含量的减少和（或）TOpoⅡ活性的降低[13]。Nakopoulou等报道，膀胱癌组织中TOpoⅡ的表达率为427%，且其表达水平降低与患者的不良预后有关[14]。我们的实验证实TOpoⅡ阳性率为281%，表达水平较低，阳性区域呈小片状散在分布，表达水平与浸润深度、淋巴结转移呈明显相关，与肿瘤组织类型、UICC分期无明显相关，但经单因素和多因素Cox比例风险模型分析显示，TOpoⅡ表达可作为宫颈癌患者一项独立的预后因素。
TS是合成胸苷酸的限速酶，可使dUMP甲基化形成dTMP，TS在宫颈癌细胞的DNA合成中起重要作用。5FU进入人体后先转变成FdUMP，再与TS和四氢叶酸共同形成三元络合物，阻止dTMP合成，从而干扰DNA的合成，达到杀死肿瘤细胞的目的[15,16]。TS的过表达使FdUMP不能完全抑制TS的作用，肿瘤细胞对5FU产生耐药。本实验结果证明宫颈癌中TS的表达与组织类型、淋巴结转移及UICC分期明显相关，与肿瘤侵犯深度无关，单因素分析TS的表达与预后有关，但多因素分析显示TS不能作为肿瘤预后的独立指标。
多因素分析显示：局部复发和淋巴结转移可作为不良预后的独立指标。提示复发肿瘤和淋巴结转移肿瘤恶性程度增加，更具浸润和转移特性。
所有病例中四种指标都表达的共12例，各个指标的表达水平之间作直线回归相关分析，结果显示： GSTπ与 TOpoⅡ之间存在明显负相关，其余均不存在相关。肿瘤细胞同时存在多种原发性耐药机制，各种机制之间的相互作用可能便利了肿瘤耐药，有关这方面的研究报道较少，尚需今后深入研究；我们实验样本偏小，得出的结果可能存在一定的偏差，尚需今后大样本实验进行验证。
总之，我们的实验证实宫颈癌中pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS的表达与肿瘤的临床病理参数之间存在不同程度的相关，因此这些指标的表达对宫颈癌化疗药物的选择以及临床预后的判断都具有重要监测意义；局部复发、淋巴结转移及TOpoⅡ、GSTπ的表达可作为检测宫颈癌患者预后的独立因素。
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