四黄汤对实验性糖尿病大鼠肾脏保护作用的研究
作者：李占林 高永荣 王惠锋 陈桂敏 薄爱华
【摘要】 目的：探讨四黄汤对实验性糖尿病（DM）大鼠肾脏保护作用的机理。方法：Wistar大鼠40只，链脲佐菌素（STZ）注射方法造模，将造模成功的32只大鼠随机分为模型组、四黄汤大剂量组、四黄汤小剂量组、开博通组4组，每组8只。另选8只性别、体重配对的大鼠做正常对照组。大剂量组给予四黄汤液40g/kg/d，小剂量组给予四黄汤液20g/kg/d，开博通组给予开博通混悬液10mg/kg/d，以上均每日一次，总疗程6周。实验过程中记录动物一般状态，并在最后一次给药后，禁食8h，称重后断头取血检测血糖、胰岛素、血脂、尿微量白蛋白、内皮素、血栓素等各项指标。取左肾称重，右肾固定，按常规制作石蜡切片和超薄切片，在光镜和电镜下观察肾脏病理变化。结果：四黄汤大剂量组的血糖、血脂、尿微量白蛋白、胰岛素、内皮素、血栓素各项指标均有明显改善。结论：四黄汤对实验性糖尿病（DM）大鼠肾脏有保护作用。
【关键词】 糖尿病;四黄汤;开博通;大鼠;肾脏
【ABSTRACT】 Objective:To study the protective effects of sihuangtang on the diabetic nephropathy and its mechanisims.Methods:Forty adult male wistar rats were studied,the diabetes model was established by intraperitoneal injection of STZ. Then 32 wistar rats were divided into 4 groups randomly: the model group,the high?dose sihuangtang group, the low-dose sihuangtang group and the captopril group, 8 rats for each group. Another 8 rats with similar weight and same sex were choser to work as control group.For high?dose group,40g/kg/d was injected while 20g/kg/d for low?dose group and 10mg/kg/d for cabtopril group. The mocess would last bweeks.The records of the average situation would be kept during the process.After final admimistration the rats would be fasted for 8h. Then weigh them and cut the heads to examine the indexs of the plasma glucose, insulin, blood faturine trace, albumin, ET and TXB2. Take out the left kidney and fix the right to make the paraffin and thinest slices. At last the variations of the pathology were observed under electrical microscope.Results: The Indexes of plasma glucose、 insulin、 blood faturine trace, albumin, ET and TXB2 were decreased remarkably.Conclusion: sihuangtang can protect the kidney of rats with diabetes.
【KEY WORDS】 Diabetic mellitus;Sihuangtang;Cabtopril;Rat;Kideny
糖尿病肾病（diabetes nephropathy DN）是糖尿病（diabetes mellitus DM）常见的严重微血管并发症之一，是糖尿病患者过早死亡及生存质量下降的主要原因，其发病率约占糖尿病患者的35%～40%[1]。西药糖尿病在降糖方面疗效肯定，但大多具有不同程度的不良反应，同时也不能有效控制其并发症，而中医药对于糖尿病并发症的防治显示了其明显的优势。因此发挥中医药优势，探索理想药物具有重要意义。四黄汤系纯中药制剂，由黄芪、黄连、大黄、生地黄、水蛭、葛根等组成，具有养阴益气生津，润燥清热化瘀的作用，在临床应用上取得了较好的疗效，本实验在建立DM大鼠模型的基础上，观察其对糖尿病大鼠血糖、胰岛素、血脂、尿微量白蛋白、内皮素、血栓素和肾脏病理形态学改变，以阐明其对实验性糖尿病大鼠肾脏保护作用的机理，为临床推广应用该药提供理论依据和资料。
1 材料与方法
1.1 DM动物模型的建立及分组 健康雄性Wistar大鼠50只，体重150～180g，大鼠适应性喂养3d，禁食12h用于实验。随机取8只作为正常组，用常规饲料喂养（饲料由河北北方学院动物实验室提供）。其余大鼠用于造模，采用一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）（50mg/kg）的方法复制大鼠实验性糖尿病模型[2]，用1%链脲佐菌素（用0.05mol/L、pH4.2柠檬酸缓冲液配制成0.5%的溶液），按50mg/kg的剂量腹腔注射。正常组注入等量柠檬酸缓冲液。72h后取大鼠尾静脉血测空腹血糖（禁食12h），测定空腹血糖大于16.7mmol/L者视为造模成功。将造模成功大鼠随机分为四黄汤大剂量组，四黄汤小剂量组，开博通组，模型组（每组8只）。正常组与模型组给予生理盐水10ml/kg/d，大剂量组给予四黄汤40g/kg/d，小剂量组给予四黄汤20g/kg/d，开博通组给予开博通混悬液10mg/kg/d，以上均每日一次，总疗程6周。
1.2 标本收集 于观察6周末处死动物，在处死前首先称重，用金属代谢笼收集24h尿液，记尿量后取5ml，3500r/min离心5min，将上清保存于-20℃冰箱待测。大鼠断头取血，混匀后注入塑料试管内，4℃ 3500r/min离心15min，分离血浆和红细胞，吸取血浆装入普通试管-20℃保存，供相关指标检测。无菌操作剖腹取肾脏，剪取2块用10%甲醛固定切片，用于病理组织学观察。并取切成1mm3的小块肾组织固定于2.5%戊二醛溶液中，用电镜观察肾组织。
1.3 检测指标 记录动物一般状态、空腹血糖（FBG）、血脂、血清胰岛素、尿微量白蛋白、血栓素、内皮素。
1.4 统计学处理 实验数据以(x±s)表示,多组间比较用F检验;两组间比较用q检验。
2 结果
2.1 模型动物的考查
造模组大鼠经STZ腹腔注射后，1周后表现出活动减少，饮水量及小便排泄量明显增多，体重增长低于正常组大鼠的特点。治疗6周后，三个治疗组大鼠均出现活动增加、饮水量及排泄量较治疗前明显减少，体重与正常组大鼠接近，说明三个治疗组大鼠的糖尿病症状都得到了改善。
2.2 四黄汤对糖尿病大鼠体重、肾脏重量、肾重/体重、血糖的影响见表1。
2.3 四黄汤对糖尿病大鼠尿微量白蛋白、血脂、血浆内皮素（ET）、血栓素（TXB2）的影响见表2。
2.4 光镜观察 正常组光镜下HE染色，见肾皮质内有大量肾小球和肾小管，肾小球内有血管球，肾小囊腔均匀（图1）。模型组肾小体大小不一，肾小囊腔宽窄不一，肾毛细血管球淤血，管腔狭窄（图2）。经6周治疗后，四黄汤大剂量组肾小体结构基本恢复正常，血管球淤血减轻（图3）。四黄汤小剂量组和开博通治疗组肾小体病变无明显好转（图4）。
2.5 电镜观察 正常组电镜下基底膜密度均匀中等（图5）。线粒体嵴丰富而清晰，细胞游离面有整齐的微绒毛(图6)。模型组肾小体内皮细胞水肿，细胞器减少（图7）。部分滤过膜受到破坏，其足突融合或基底膜增厚，出现驼峰现象或电子密度高低不等（图8）。部分近曲小管上皮细胞肿胀，线粒体呈空泡状，线粒嵴消失，上皮细胞游离面绒毛消失，严重者细胞游离端崩解（图9）。经6周治疗后，四黄汤大剂量组内皮细胞水肿消失，细胞器增多，滤过膜结构恢复正常，足细胞突起排列整齐，基底膜无明显增厚区（图10）。肾小管上皮细胞基本恢复正常，可见包质中线粒体增多，包质水肿消失，微绒毛整齐（图11）。四黄汤小剂量组和开博通治疗组肾小球基膜三层结构模糊不清，血管内皮细胞肿胀变性、管腔狭窄（图12）。肾小管上皮绒毛部分脱落，线粒体肿胀及空泡变性。2005年12月李占林等：四黄汤对实验性糖尿病大鼠肾脏保护作用的研究第6期2005年12月河北北方学院学报（医学版）第6期表1 四黄汤对糖尿病大鼠体重、肾脏重量、肾重/体重、血糖、胰岛素的影响注：各组间比较：*Ｐ＞0.05;与模型组比较：**Ｐ<0.05;与正常组比较：＃Ｐ<0.01 表2 四黄汤对糖尿病大鼠尿微量白蛋白、血脂、血浆内皮素（ET）、血栓素（TXB2）的影响
3 讨论
3.1 四黄汤用于防治糖尿病肾病中西医理论依据
中医学理论认为糖尿病肾病属中医学“消瘅”“水肿”“腰痛”等范畴，笔者认为，DN是在糖尿病阴虚燥热的基础上而来的，日久阴损及气，久病及肾，而致气阴两虚，脾肾亏虚，继而使水液内停，痰浊孳生，久病入络，络脉血瘀，故瘀血痰浊与DN有着密切的关系。治疗以养阴益气生津、润燥清热化瘀为原则。中医药理论认为[3]：大黄具泻热毒，破积滞，行瘀血之功效；黄芪具有利水消肿，补中益气的作用，从而达到益气生津的功效；黄连具有泻火，燥湿，解毒功效；生地有清热凉血，养阴生津的功效；葛根具有生津止渴的功效,水蛭具有破血逐瘀消疒徵的功效。故本方由大黄、黄芪、生地、黄连、水蛭、葛根共奏养阴益气、生津清热润燥化瘀之功效，符合中医学理论。
综合医学对“四黄汤”组方中各单味药研究认为：大黄可降低糖尿病鼠的血清甘油三酯和胆固醇；能明显改善DN大鼠的肾功能,抑制肾脏肥大,减少蛋白尿。黄连中的主要成分是小蘖碱，小蘖碱可降低喂高胆固醇乳剂小鼠的血清胆固醇。黄芪可增加三羧酸循环中关键酶“琥珀酸脱氢酶”及心肌细胞乳酸脱氢酶的活性，从而使乳酸易于转化成丙酮酸，有利于氧化作用，减少了糖异生的原料。生地有降低血糖，抗缺氧、抗炎、保护心脏的作用。水蛭素可防治各种实验性血栓形成。葛根能抑制蛋白非酶基糖化，因此能降低糖尿病大鼠的糖化血红蛋白含量，从而保护肾脏。综上所述，可知四黄汤中各味单药对糖尿病大鼠的肾脏有一定的保护作用。
3.2 四黄汤对糖尿病大鼠的影响
3.2.1 控制糖尿病肾脏肥大
糖尿病肾病肾脏肥大是出现最早、最明显的肾脏病理改变，能否控制糖尿病肾脏肥大，是本病有无成效的标志之一，而肾重/体重比值是衡量肾脏肥大的较客观指标，它可以排除因体重影响对肾重的观察[4]。实验结果表明，糖尿病模型大鼠经四黄汤治疗后，肾脏重量有下降趋势，肾重/体重比值明显降低，提示四黄汤可使糖尿病模型大鼠的肾脏肥大得到控制，且疗效优于开博通。
3.2.2 四黄汤能调节胰岛素分泌，有效控制血糖水平。
大量研究已证明，降低血糖水平可减轻糖尿病肾脏损害的程度[5]，本实验结果显示，四黄汤大剂量组可降低糖尿病大鼠血糖，现代医学认为，糖尿病的病理生理特点是胰岛素分泌绝对或相对不足，以及靶组织、细胞对胰岛素的敏感性降低，从而引起糖、蛋白质，脂肪代谢紊乱及其继发的水、电解质、酸碱代谢失衡。临床上以高血糖为共同标志。因此，血糖是观察模型动物的最主要指标，可反映糖尿病程度和药物治疗的效果。本实验验证了大剂量四黄汤可显著降低STZ引发的糖尿病大鼠的血糖。
3.2.3 降低血甘油三酯，胆固醇
有研究指出，DN与脂代谢紊乱亦有密切关系，并且这种紊乱在DN早期就已存在[6]。糖尿病病人大多存在脂代谢紊乱。四黄汤中黄芪能抑制血小板的功能，对ADP诱发的血小板聚集有抑制作用。此外，黄芪还可显著扩张外周血管，促进微循环，黄芪还可直接减少内源性胆固醇的生成。所以四黄汤在治疗糖尿病脂质代谢紊乱方面有优于西药的优势。
3.2.4 四黄汤可降低尿微量白蛋白
尿微量白蛋白排泄是诊断早期糖尿病肾病的重要指标，因此，逆转或消除尿微量白蛋白是临床极为关注的一个问题。本实验中糖尿病大鼠用四黄汤治疗后，尿微量白蛋白排泄明显减少，提示肾小球滤过屏障通透性得以改善。提示四黄汤对糖尿病所致肾小球损伤有较好的疗效，是防治实验性糖尿病大鼠肾脏病变的有效制剂，并在组织病上亦得到证实。
3.2.5 四黄汤能降低血中内皮素（ET）及血栓素B2（TXB2）含量。
肾脏是合成ET的主要器官。ET是由21个氨基酸组成的酸性多肽，主要由内皮细胞合成释放，是迄今发现的最强的血管收缩物质[7]，其作用广泛，有较强血管收缩作用，并促进血管内皮细胞生长、增殖和细胞外基质的合成及刺激血管内皮细胞合成释放凝血酶，形成局部血栓等作用。肾脏的肾小球毛细血管内皮细胞是合成ET的重要来源，对肾脏的血液动力学变化有重要调节作用。当肾脏受到各种免疫炎症损害时肾血管内皮细胞产生ET增加，同时肾小管分泌ET增加，可显著减少肾脏血流量和肾小球滤过率[8]。本组结果显示DM大鼠血浆ET值较正常组明显升高。血栓素B2（TXB2）也是目前发现的强烈缩血管活性多肽。血栓素是花生四烯酸在血小板中的血栓素合成酶的作用下,生成的强血管收缩剂和血小板聚集诱导剂。在糖尿病时,由于花生四烯酸代谢异常及血管内皮损伤，促使血小板聚集，血栓素释放增多，而且糖尿病患者血浆血栓素与ET呈明显正相关。本实验用四黄汤治疗后，已升高的ET和TXB2明显降低。
3.2.6 四黄汤减少STZ对于肾脏损伤，保护肾组织。
DN是DM较常见而严重的慢性并发症之一，其早期主要病理表现为：肾脏肥大、肾小球肾小管基底膜增厚、系膜区扩大、细胞外基质（ECM）增多等[9]。本研究显示，四黄汤大剂量组对上述改变有明显的改善。推测四黄汤保护肾脏的机理与其养阴益气、生津清热润燥化瘀，改善机体内环境，促进组织器官的血液循环，减轻肾脏功能损伤有关。总之，四黄汤对实验性糖尿病大鼠肾脏有保护作用，其作用是通过多环节、多层次发挥的，其中机理包括：降低血糖，降低血脂，降低尿微量白蛋白，降低血栓素、内皮素，升高血清胰岛素等，还可能是几种机制的协同作用，是一个综合的效应过程，具体的机理还有待进一步的研究证明。
【】
1 林善琰.糖尿病肾病研究的几个关键[J].中华肾脏病杂志， 2000，16（2）：69
2 Richard E，Gilbert AC,Leonard L，et al.Expression of transforming growth factor?β1 and type VI collagen in the renal tubulionters titium in experimental diabetes:effects of ACE inhibition[J].Diabetes,1998,47:414
3 凌一揆主编.中药学[M].第一版.上海科技出版社，1984.212?246
4 叶任高，刘冠贤.临床肾脏病学[M].北京:人民卫生出版社,1997.54?56
5 Grupe WE.Minimal Change disease[J]. Semin Nephrol,1982,2:241
6 余叶蓉.糖尿病肾病脂代谢紊乱的研究[J].糖尿病杂志，1996，16（1）：47
7 王海燕.肾脏病学[M].第二版.北京：人民卫生出版社，1998.103?104
8 Perico N,Remuzzi G.The possible role of endothelin in the process of progressive renal deteriration in experimental and human glomerulopathies seminars [J]. In Nephrology, 1993,13:137
9 Nerlich A,Schleicher E.Immunohistochemical localization of extracellular matrix components in human diabetic glomerular lesions[J]. Am J Pathol, 1991,139:889?899
