增强型绿色荧光蛋白基因转染CHO细胞研究
作者： 郑立恒 魏会平 许松梅 孙伟华 李保国 胡火珍 刘全胜
【摘要】目的：探讨增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP)在中华仓鼠卵巢细胞（CHODHFR）细胞中的作用。方法：将增强型绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA31(+)EGFP, 转染至培养的中华仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary, CHODHFR-）中。结果：成功表达并产生绿色荧光。结论：证明EGFP是一种良好的报告基因和筛选标志，为进一步研究应用最广泛的哺乳动物细胞表达系统―CHO细胞表达系统奠定了基础。【关键词】增强型绿色荧光蛋白；转染；中华仓鼠卵巢细胞
eukaryotic expression vector pcDNA31 (+) in enhanced green fluorescent protein,EGFP was transfected into Chinese Hamster Ovary (CHO) cells.CHO cells transfected by EGFP were selected by G418 and then monitored under microscope for observation of the emission of green fluorescence.Results:The results showed that the CHO cells transfected by EGFP expressed green fluorescent protein successfully.Conclusion: Implying that EGFP was a good reported and seleted marker molecule in mammalian cells.This laid the foundation for investigation of CHO cells system which is the most popular mammalian cells expression system.
【KEY WORDS】Enhanced green fluorescent protein;Transfect;CHODHFR
近年来，研究者们对从维多利亚水母中克隆得到的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）这一报告的标记基因产生了浓厚的兴趣[1]，荧光显微可以监视GFP的表达情况，表达时不需要加入抗体、辅因子、酶底物等其他成分，不影响宿主细胞。GFP是一种稳定蛋白，即使在比较高浓度的强毒性药剂（如HCI胍、尿素、硫酸盐等）中延长孵育时间荧光仍可持续存在[2]。因此GFP可以鉴定、跟踪、分选表达GFP的细胞，GFP已成为细胞生物学和分子生物学中广泛应用的报告蛋白[3]。CHO DHFR-细胞由于已成功表达了多种重组蛋白而成为公认的化生产活性蛋白的重要工具。EGFP基因是在GFP基因基础上改造而来的一种GFP基因的突变体，具有在动物细胞中表达较强荧光的特点。本研究旨在探讨EGFP在CHODHFR细胞中的表达情况。
1材料和方法
11材料
pcDNA31(+)EGFP质粒，宿主菌BL21由本实验室提供，CHODHFR购自ATCC公司，G418购自GIBCO BRL公司，胎牛血清、质粒回收试剂盒购自SIGMA公司，脂质体购自Roche公司，alphMEM（+）培养基购自Ivitrogen公司，胶回收试剂盒购自博大泰克生物公司。
12方法
121转化和质粒鉴定将pcDNA31(+)EGFP质粒转化宿主大肠杆菌BL21，在长波紫外灯下筛选鉴定所需的发出绿色荧光的克隆，得到含所需质粒的菌落，进行测序鉴定。
122质粒的大量制备和纯化100ml的三角烧瓶内加入含氨苄青霉素（01×10-3 g/ml）的LB培养基30ml,含pcDNA31(+)EGFP质粒的细菌培养物1ml,37℃剧烈摇菌过夜，用试剂盒提取和纯化质粒。
123细胞培养37℃水浴复苏冻存的 CHODHFR细胞，用含10%胎牛血清和双抗的alphMEM（+）培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，3d后传代，当细胞稳定生长后传入25mm培养盘中，当细胞生长至50%~80%融合后进行转染。
124基因转染按脂质体转染试剂盒说明书进行操作，实验中设未转染的细胞作为对照。
125阳性克隆的筛选和荧光显微镜观察细胞转染24h后换筛选培养基，其中加入G418（400×10-6g/L），三天换液一次，维持筛选作用。期间用普通显微镜观察细胞死亡情况并照相。两周后对照细胞完全死亡，转染细胞单克隆形成，此时进行荧光显微镜观察并照相。
2结果
21pcDNA31(+)EGFP质粒测序
经过测序序列完全正确，得到所需质粒。
22pcDNA31(+)EGFP质粒转染CHODHFR细胞后的情况
转染的细胞5d后已经大多数死亡，8d后几乎全部死亡，然后处于稳定状态既不继续死亡也不增殖，13d后细胞开始增殖，15d单克隆形成。荧光显微镜观察可见细胞发出明显的绿色荧光，而未转染的细胞未见荧光表达。
2006年2月郑立恒等：增强型绿色荧光蛋白基因转染CHO细胞研究第1期2006年2月河北北方学院学报（医学版）第1期pCDNA31(+)EGFP质粒转染的CHODHFR细胞
图1转染5d时的细胞图2转染8d时的细胞
图3转染15d时的细胞图4发荧光的细胞
3讨论
CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，有利于外源蛋白的后分离，产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质接近，糖基化等后加工准确[4]。本实验是先研究EGFP在细胞内的表达情况，紧接着我们将进行EGFPIG这种融合蛋白的表达研究，本实验的成功将为我们以后的实验奠定良好的基础。
绿色荧光蛋白（GFP）在细菌、真菌、植物和动物细胞中表达时都能够发出绿色荧光，没有种属特异性，并且不干扰细胞的正常生长，这使它成为一种理想的荧光标记蛋白[5]。GFP基因以其可以活体表达，可以较准确的定位蛋白，可以随时监视蛋白的表达水平，不需加入辅助物质就可发光，检测方便，荧光不受热、pH、化学变性剂的影响而高度稳定的特性深受到研究者喜爱[6,7]。GFP基因分子量小，易于与其它基因形成融合基因，并且所获融合基因不影响自身和目的基因的空间构象和功能，广泛应用于蛋白体内定位的研究[8]，下一步我们要做的EGFPIG是一种分泌蛋白，荧光是很好的定位标志。我们应用的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因是在水母来源的野生型GFP的基础上替换了影响荧光表达效率的基因合成的，由于选用了哺乳动物偏爱的密码子，可以显著提高其在动物细胞中的荧光效能。
由于CHO细胞没有绿色荧光蛋白基因，本实验初步成功的表达了绿色荧光蛋白，进一步我们准备表达融合蛋白基因EGFPIG，再下一步将进行其它药物融合蛋白的表达，这个实验为以后的工作奠定了基础。
1Prasher D C,Eckenrode V K,Ward W W,et al.Primary structure of the Aequorea Victoria greenfluorescent protein[J].Gene,1992, 111: 229233
2Alexander N G, Bindu R, Joyce M N, et al.Longterm,stable expression of green fluorescent protein in mammalian cells[J].Biochem Biophys Res Commun, 1997, 263: 347350
3Wu Z J,Wu X B,Wang H,et al.hEPO transfer and expression by recombinant adenoassociated virus vector[J].生物化学与生物物报，2002，34（2）：176180
4申烨华，耿信笃.CHO细胞表达系统研究进展[J].生物工程进展，2000，20（4）：2325
5Cormack B P,Valdivia R,Falkow S.FACS optimized mutants of the green fluorescent protein(GFP)[J].Gene,1996,173(1):332338
6段小军,杨柳,周跃,等.不同荧光蛋白标记技术对兔骨髓基质干细胞体外增殖的影响.中华创伤骨科杂志,2004,6(7):731734
7Ehrhardt D.GFP technology for live cell imaging[J].Curr Op in Plant Biol,2003,6:622628
8Wei DY,Dai B B,Chen S S,et al.The exp ression of adenoviral mediated gfp reporter gene in tumor cells induced and regulated by irradiation[J].生物化学与生物物理学报,2001,33(1):123127
