DNA甲基转移酶3B在异常发育中作用的研究进展
【关键词】 DNA甲基化 DNA甲基转移酶 胚胎发育 CpG岛
正常的DNA甲基化模式对于哺乳动物细胞的生长和发育至关重要，其通过基因沉默、印迹清除和重建、X染色体失活等作用于胚胎发育期在细胞内建立特异的DNA甲基化模式，这种模式在胚胎发育和细胞增殖过程中能稳定传递，影响个体整个生长、发育过程。DNA甲基转移酶3B(DNA methyltransferase 3B，DNMT3B)是哺乳动物体内的DNA重新甲基化酶之一,在建立和维持个体的DNA甲基化模式的过程中起到了非常重要的作用。 关于DNMT3B的研究已经越来越成为众多研究者关注的热点。
脊椎动物DNA链中的CpG岛存在甲基化，CG序列的甲基化主要发生于胞嘧啶C5，这些CG序列中有70%～80%是通过某种细胞类型特异性模式来修饰的[1]。胚胎发育、细胞分化、X染色体的失活、基因组印记以及转位子的抑制等过程中的基因调控都涉及了DNA链中CpG岛的甲基化[2]。基因组DNA的甲基化主要通过DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs) 来完成[3],DNMT催化S腺苷L甲硫氨酸的甲基基团转移至DNA胞嘧啶的5′C上,实现DNA甲基化,建立和维持基因表达调控模式。目前哺乳动物中的DNMT主要由DNMT1、DNMT2、DNMT3等3个家族组成。DNMT1的主要作用是维持基因组DNA的甲基化水平，它是哺乳动物中唯一对半甲基化的位点有很强偏好性的DNA甲基转移酶[4]。DNMT2是真核生物中最小的DNA甲基转移酶，到目前为止它的生物学功能还不是很清楚。DNMT3家族包括DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。DNMT3A、DNMT3B的主要作用是催化DNA重新甲基化,其N末端都包含一个类似ATRX的结构域(或称为Plant Homeodomain?PHD结构域）和一个PWWP ( proline?tryptophan?tryptophan?proline)结构域，这两个结构域在与其他蛋白的相互作用及异染色质的定位中有一定作用 [1]。DNMT3L虽没有明确的甲基催化活性，但它在母源基因组印记的建立中起了主要作用，同时它还是DNMT3A、DNMT3B催化活性的刺激因子[5]。
1 DNMT3B和DNMT3A生物学作用的比较
DNMT3A和DNMT3B负责在生殖细胞、胚胎干细胞中以及胚胎发育时期建立DNA甲基化模式，尽管两者的氨基酸序列和生化活性有很明显的相似，但它们却有着不同的生物学作用[6]。在小鼠中研究发现,DNMT3B蛋白在E4.5～E7.5(embryonic day 4.5～7.5)是高表达的,随后明显下降,于E9.5时达最低水平；E10.5后才可检测到DNMT3A蛋白,在已分化细胞和成体组织中DNMT3A和DNMT3B都是低表达的,而且DNMT3B的表达水平明显低于DNMT3A[7]。DNMT3A缺失的小鼠胚胎发育不全，出生后3到4周死亡；缺乏DNMT3B的小鼠胚胎受精后发育不超过9.5 d即死亡。此外，DNMT3A对裸露的DNA甲基化效率比较高，而很少对核小体核心部位的DNA进行甲基化作用，与之相反，DNMT3B却对核小体核心部位的DNA有明显的甲基化作用[8]。
2 DNMT3B和胚胎发育
胚胎发育时,基因组的DNA甲基化经历了一个动态的重新编程过程,主要表现为受精后基因组的普遍去甲基化和植入后广泛的重新甲基化。DNMT3B对胚胎的正常发育至关重要,研究显示，DNMT3B基因完全敲除小鼠通常在胚胎发育至14.5～16.5 dpc（days post coital）时死亡。目前认为DNMT3B基因完全敲除小鼠的胚胎致死可能和以下因素有关：正常情况下DNMT3B抑制一些调控细胞生长的基因，DNMT3B基因完全敲除后导致这些基因的失控，从而导致细胞生长停滞；DNMT3B基因完全敲除小鼠胚胎中分离出来的MEF(mouse embryonic fibroblast)细胞呈现早衰现象[9]；在DNMT3B基因完全敲除小鼠中发现的多发性心血管缺陷也可能是导致胎死的原因；正常情况下，DNMT3B在胎盘组织中高度表达，当其被敲除后导致胎盘发育缺陷，进而导致胎死[10]。
DNMT3B基因完全敲除的小鼠在胚胎时期死亡，但是携带DNMT3B基因 ICF (immunodeficiency centromeric instability and facial anomalies) 错义突变小鼠可以足月分娩，同时表现出和人类ICF 综合征患者相似的表型。ICF 综合征是一种少见的常染色体隐性遗传病，患者可以存活至成年期，但是表现出多种缺陷，其中免疫缺陷和颅面部异常是最明显症状,其异常染色体特异性的定位于外周淋巴细胞1号和16号染色体着丝粒周边区域，偶有9号染色体异常[11]。ICF综合征是迄今为止发现的唯一一种由DNMT3B基因突变所导致的疾病，通过ICF患者与正常人之间的DNMT3B基因对比发现，DNMT3B基因突变主要集中在C末端催化区（图1［12］），这很可能直接影响了DNMT3B的酶活性。
3 DNMT3B和肿瘤
肿瘤的形成受到多种因素影响。研究证实，在众多类型的肿瘤中，肿瘤细胞的DNA甲基化状态发生改变，主要表现为基因组总体的甲基化水平降低与特定基因启动子区CpG岛的甲基化水平升高[13]。众所周知，DNA甲基化主要是由DNMTs来完成，因此，DNMTs与肿瘤细胞中发生的DNA甲基化状态改变之间的关系以及DNMTs在肿瘤发生中的作用成为众多学者关注的问题。
肿瘤细胞中DNA甲基化状态的改变不仅仅涉及了DNMTs在细胞内的催化作用，同时，DNMTs本身作为一种作用因子和其他活性蛋白的相互作用同样对肿瘤细胞的DNA甲基化状态产生影响，所以，关于DNMTs在肿瘤细胞中的表达水平以及它和其他蛋白协同作用的研究同样受到重视。
目前众多研究显示，在肿瘤细胞中普遍存在DNMT3B的高表达[14]，但一些研究报道DNMT3B在肿瘤细胞中呈表达下调。Park等[15]发现，在肝细胞癌中HBx蛋白(乙肝病毒X蛋白) 通过下调DNMT3B基因表达水平来诱导Satellite 2 重复序列的整体低甲基化，这提示DNMT3B在肿瘤组织中的表达情况可能因肿瘤类型、肿瘤发生发展阶段等不同而存在差异。Liu等[16]在肺癌细胞系中发现香烟抽提物（cigarette smoke extract，CSE）可以通过特异性地下调DNMT3B的表达水平来诱导神经蛋白质synuclein?gamma(SNCG)蛋白的表达，且RNA干扰DNMT3B的表达直接地增加SNCG mRNA 表达水平。
Rhee等[17]利用同源重组方法将HCT116（人结肠癌细胞系）细胞的DNMT3B基因和DNMT1基因敲除，结果发现在DNMT3B基因和DNMT1基因双敲除的HCT116细胞基因组中出现了明显的去甲基化，其甲基化水平仅为野生型HCT116细胞基因组的3%左右。 Beaulieu等[18]用isotype?specific antisense inhibitors的方法在HCT116等细胞系中将DNMT3B基因和DNMT3A基因敲除，他们发现DNMT3B基因敲除后可以诱导肿瘤细胞的凋亡，DNMT3A基因敲除则不能诱导肿瘤细胞凋亡,而在正常组织的细胞中DNMT3B基因或DNMT3A基因敲除均不能产生相同的诱导作用，他们同样发现DNMT3B基因敲除可以重新激活肿瘤细胞中甲基化沉默基因的表达，表明DNMT3B对于调节肿瘤细胞的生长及异常基因沉默有非常重要的作用[18]。
4 DNMT3B基因单核苷酸多态性在肿瘤风险预测中的研究 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNPs）是最常见的一种遗传变异形式，许多研究已经证实了一些酶变异体可以影响酶的表达和活性，因此推断这些变异体可能和肿瘤的高发风险有密切的联系[19]。Lee 等[20]研究了DNMT3B基因283T>C 和-579G>T 在原发性肺癌发生中的情况，提示至少含有1个-283T等位基因的个体可以明显降低患肺腺癌(AC)和小细胞肺癌(SM)的风险；至少含有1个-579G等位基因可以明显降低患肺腺癌(AC)和小细胞肺癌(SM)的风险。DNMT3B基因-283T>C 多态性改变明显降低了DNMT3B基因启动子的活性，从而影响了DNMT3B基因的表达,因此，他们认为DNMT3B基因-283T>C增加了个体对肺癌的易感性。此外，还有其他一些研究显示DNMT3B基因-579G>T多态性改变可以明显地增加个体患肺癌、头颈部肿瘤、乳腺癌及结肠腺癌的风险[20?22]。DNMT3B基因-149C>T 是一个相对较晚鉴定出来的多态性改变，体外实验显示，DNMT3B基因-149C>T可以使DNMT3B基因启动子活性增加30%[22]。Shen等[21]报道了它和韩国人肺癌发病风险的增高有着密切的关系。
对于DNMT3B基因启动子区SNPs的研究可能会因为地区和种族的不同而产生不同的结果，因此，针对某一地区人群的DNMT3B基因SNPs的研究结果可能并不适用其他的地区。Wu等[23]报道的关于DNMT3B -149C>T在汉族人群原发性肝癌中的研究结果显示，原发性肝癌患者和健康对照组的C、T等位基因的分布频率无明显区别，提示了DNMT3B基因-149C>T 多态性改变可能和原发性肝癌的发生没有明显的关系。
5 DNMT3B和其他一些异常发育
Hayward等[24]在对家族性葡萄胎(FBHM)的研究中发现，DNMT3B缺失所引起的染色体或者其他蛋白的改变与FBHM的发生有密切的关系。Wu等[25]研究发现，和正常人的子宫内膜及子宫内膜异位症患者的正常子宫内膜相比较，DNMT3B在异位的子宫内膜中表达明显升高。OFCD（Oculo?facio?cardio?dental syndrome)综合征是一种少见的先天性异常综合征， Hedera等[26?27]发现OFCD和X染色体失活机制异常有关，而DNMT3B在X染色体的失活过程起了非常重要的作用。有研究还发现DNMT3B的C末端的5个甲基转移酶序列区域在α?地中海贫血/精神迟缓综合征中失活。此外，在一些癌前病变的组织细胞中，同样存在着DNA甲基化状态的改变，并伴随DNMT1和DNMT3B的表达异常。Kanai等[28]提出，存在DNA甲基化状态异常的癌前病变组织恶化的速度可能比较快，同时可能产生恶性程度较高的转化，这可能和DNMT3B的异常剪接和DNMT1的高表达有关。
6 结 语
DNMT3B在机体的正常发育及某些生物学功能的执行中起到了重要的作用，它不仅参与了胚胎发育及其它一些异常发育，同时参与了肿瘤的发生、。尽管对DNMT3B的大量研究结果提示，DNMT3B在多种生物学过程中扮演了非常重要的角色，但目前对DNMT3B研究还只是停留在一个表层阶段, 还需要不断的深入。相信不久的将来，随着DNMT3B及其他DNMTs包括DNMT1/DNMT3A在正常发育及异常发育作用机制的不断阐明，尤其是在肿瘤的发生发展中作用的揭示，将会对临床肿瘤的诊断、及预后产生重要影响。
致谢 南京市妇幼保健院许争锋主任为本文的撰写提出了宝贵建议和指导！
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