Thanatin突变体在大肠杆菌中的表达及纯化
作者：顾林，文良柱，吴国球，徐寒梅，沈子龙
【摘要】 目的:在大肠杆菌中克隆表达thanatin突变体（Th?T）蛋白并纯化。 方法:PCR合成Th?T基因并克隆到pET32a载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建Th?T原核表达载体（pET32a?Th?T）并转化到大肠杆菌BL21融合表达，通过正交实验优化表达条件，His?Bind介质纯化。考察经酶切纯化后的重组Th?T对4种供试菌的最低抑制浓度。结果:菌体在LB培养基（pH 6?5）培养4.5 h，IPTG 0.4 mmol·L－1诱导7 h，Th?T融合蛋白大量可溶性表达，经药敏试验证明纯化的重组Th?T具有预期的抗菌活性。结论:本研究为通过大肠杆菌体系表达重组Th?T抗菌药物奠定了基础。
【关键词】 thanatin；突变体；大肠杆菌；融合蛋白；纯化；表达；药敏试验
Thanatin是在昆虫斑腹刺益蝽（Podisus maculiventris）中发现的，由21个氨基酸残基组成的广谱抗菌肽，对革兰阳性、阴性菌以及某些真菌均有抑制作用，而且对一些临床上的耐药菌也有良好的抗菌活性[1]。Lee等[2]研究了thanatin的各种突变体，发现将其结构中第15位的苏氨酸残基删除后，对革兰阳性菌的抑制效果增强，而对革兰阴性菌和真菌的最小抑菌浓度不变，其二级结构仍保持thanatin原有的结构，即N末端7个氨基酸臂和C末端的14个氨基酸组成的β片层结构,通过抑制细胞呼吸达到抗菌的效果[3]。目前国内外对thanatin已有深入的研究[4?5]，而对具有更佳抗菌效果的突变体相关研究却比较少。本研究旨在将人工合成的thanatin突变体（Th?T）基因克隆到pET32a融合表达载体中，通过正交设计考察培养基pH值、诱导剂用量及诱导时间与融合蛋白表达水平的关系，使融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效可溶性表达，纯化融合蛋白并经凝血酶切割，考察纯化的重组Th?T作为抗菌药物的应用价值。
1 材料与方法
1.1 菌种和载体大肠杆菌菌株BL21(DE3)和pET32a载体由第一作者所在实验室保存，标准菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和铜绿假单胞菌由药科大学微生物学教研室提供。
1.2 酶和试剂限制性内切酶、Taq酶、dNTPs、DNA marker、异丙基硫代?β?D半乳糖苷（IPTG）为MBI产品，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，丙烯酰胺、亚甲基双丙烯胺及Tris碱为BBI产品，低分子质量蛋白质标准品为Promega公司产品；His?Bind Resin为Novagen公司产品，Thrombin及其10倍缓冲液为Sigma公司产品，结合缓冲液、洗涤缓冲液及洗脱缓冲液按Novagen His?Bind Resin 试剂盒配制，其余试剂为进口分装产品。
1.2 方法
1.2.1 Th?T基因的合成与表达载体pET32a?Th?T制备及转化
1.2.1.1 Th?T基因的合成 根据Th?T基因的氨基酸序列GSKKPVPIIYCNRR GKCQRM和大肠杆菌的偏爱密码子逆推出突变体的cDNA序列，并设计出PCR的引物。引物1：CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACT TACCCCTACGGTTAC AGTAGATTATC;引物2：GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAG CCTGTC CCGATAATCAACTGTAAC。单下划线序列为限制性内切酶切位点，双下划线为编码凝血酶酶切位点的序列。引物1和2互为模板，PCR扩增基因。PCR反应体系（50μl）：引物浓度2μmol·L-1，dNTPs 40μmol·L-1，MgCl2 1μmol·L-1，Taq酶0.5 U，PCR反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 7min。
1.2.1.2 表达载体pET32a?Th?T构建 PCR产物经纯化后用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切得到的片断由BamHⅠ和XhoⅠ位点克隆到载体pET32a，转化到大肠杆菌BL21菌株，涂布含氨苄青霉素100mg·L-1的LB平板，37℃培养过夜，挑选克隆培养提取质粒，BamHⅠ和XhoⅠ单酶切验证，进一步测序确定（由上海生工生物工程有限公司完成）。
1.2.2 融合蛋白可溶性表达的条件优化 将测序正确的阳性菌株转入含氨苄青霉素100mg·L-1的LB培养液，37℃培养过夜。挑选1个单克隆菌落，转入含氨苄青霉素100μg·ml-1的LB培养液，37℃培养过夜作为种子液，取适量菌液。按1％的接种量放大培养，在摇瓶条件下摸索融合蛋白表达的最佳条件。正交设计在单因素考察的基础上，取4因素（培养基pH值、诱导剂用量、加诱导剂前的培养时间、诱导时间）各4水平按L16（45）进行正交设计（见表1）。其他条件包括氨苄青霉素浓度（100mg·L-1）、培养温度（37℃）、转速（200 r·min-1）等均保持一致。设定综合评分指标Y进行综合评分，Y=Y1*Y2,其中Y1为菌液OD600吸收值，Y2为融合蛋白占总可溶性蛋白的百分比。
表1 正交设计的水平和因素（略）
Tab 1 Factors and levels of the orthogonal experimental design
1.2.3 Th?T融合蛋白的纯化
1.2.3.1 硫酸铵分级沉淀法沉淀融合蛋白 将超声破碎后的菌体破碎液13 000 r·min-1离心15min，在25℃进行硫酸铵分级沉淀。选取硫酸铵溶液的饱和度为20％、30％、40％、50％、60％进行实验，用50 mmol·L-1 Tris?HCl(pH 8.5)溶解后，考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒测定其蛋白含量，用SDS?PAGE进行分析。
1.2.3.2 His?Bind亲和层析纯化融合蛋白 由于重组载体带有His?Tag，故使用His?Bind亲和层析柱纯化融合蛋白。取10 ml的Ni?Resin装入层析柱（1 cm×20 cm）中，充分平衡后上样，用10倍柱体积的Binding buffer和6倍柱体积的Washing buffer洗涤，最后用6倍柱体积的Elute buffer洗脱样品。全过程流速为1 ml·min-1，检测波长为280 nm。将洗脱的样品在20 mmol·L-1 Tris?HCl (pH 8.5)溶液中透析24 h，－20℃保存备用。
1.2.4 融合蛋白的酶切及酶切产物的纯化 将已透析除盐后的融合蛋白定量，加入适量凝血酶，22℃下酶切16 h。酶切产物用0.22μm滤膜过滤，用C18 Octadecyl反相制备色谱柱（Bio?Rad）分离，含0.05%三氟乙酸的乙腈水为流动相，乙腈浓度从5％～95％梯度洗脱，检测波长280 nm，收集的样品峰冻干保存，并测定多肽分子质量（由中国科技大学完成）。
1.2.5 重组Th?T的药敏试验 采用美国临床实验室标准委员会（NCCLS）推荐的药敏试验方法——微量稀释法。在无菌的96孔板中，每个小孔装肉汤培养基0.1 ml，供试菌液按1×109 CFU·L－1的浓度接种100μl。第1～9孔分别由高浓度至低浓度加入按倍比稀释的抗菌肽溶液10μl，第10孔为不加Th?T的生长对照，第11孔为培养基无菌（无菌液和Th?T）对照，第12孔为加入相应抗生素的阳性对照（氨苄青霉素的终浓度为100mg·L-1）。接种好的微量稀释板放于37℃水浴恒温箱中孵育24～36 h。用低倍显微镜观察每个孔中供试菌的生长情况。 最低抑制浓度的判定是在最高药物稀释倍数条件下，观察到的无菌生长孔转种后仍无菌生长时，即为Th?T对此细菌的最低抑制浓度。本试验按此方法考察纯化的重组Th?T对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和铜绿假单胞菌4种供试菌的最低抑制浓度。
2 结果
2.1 Th?T基因的合成与表达载体pET32a?Th?T的构建 PCR产物用2％琼脂糖电泳验证，如图1，大小为90～100 bp。表达载体pET32a?Th?T经BamHⅠ和XhoⅠ单酶切验证正确，送上海生工生物工程有限公司测序结果表明序列正确。
1.PCR产物； 2.DNA标准分子质量
图1 PCR反应的电泳检测图（略）
Fig 1 Result of the PCR
2.2 融合蛋白可溶性表达的条件优化根据正交设计表，按极差大小可得各因素对指标影响次序为B＞A＞D＞C,各因素的组合以B4A2D4C4为最佳。即IPTG终浓度为0.4 mmol·L-1，LB培养基pH 6.5，菌体培养4.5 h后加入诱导剂，诱导时间为7 h。结合单因素考察结果，确定优选的表达条件如下：从含氨苄青霉素100mg·L-1的LB平板上挑选单菌落，转接到含氨苄青霉素100mg·L-1的LB培养液，37℃培养过夜。按1％接种量在pH 6.5的LB培养基中放大培养，转速200 r·min-1，37℃下培养4.5 h后加入终浓度为0.4 mmol·L-1的IPTG，再培养7 h后收集菌体。每升发酵液可以得到4 g湿菌，融合蛋白占可溶性总蛋白70％以上。
2.3 Th?T融合蛋白的纯化
2.3.1 硫酸铵分级沉淀法沉淀融合蛋白 如图2所示，绝大多数融合蛋白可以在30%～50％的硫酸铵饱和溶液浓度下沉淀出来，而其他杂质蛋白在此浓度范围内沉降较少，故选取在30％～50％的硫酸铵饱和浓度范围内沉降出的蛋白为融合蛋白。
1.蛋白质标准分子质量；2.菌体破碎上清液总蛋白；3～7.分别在0~20%、 ~30%、~40%、~50%、~60%的硫酸铵饱和浓度下沉淀出的总蛋白
图2 硫酸铵法分级沉淀融合蛋白（略）
Fig 2 Determination of saturation percentages of ammonium sulphate in precipitating fusion protein
2.3.2 His?Bind亲和层析纯化融合蛋白 使用His?Bind柱对融合蛋白的洗脱曲线如图3所示。实验表明不含His?Tag的杂蛋白因不能与树脂结合，在使用结合缓冲液和洗涤缓冲液洗脱时被洗涤出来。而使用含200 mmol·L-1咪唑浓度的Elute buffer，可以将融合蛋白从柱上洗脱，经SDS?PAGE检测其蛋白纯度为85％以上，可见His?Bind柱对His?Tag的融合蛋白纯化效果比较理想。
2.4 融合蛋白酶切产物的纯化融合蛋白经凝血酶切割后，在制备型反相色谱柱上分离得到3个主要的洗脱峰，洗脱曲线见图4。经分子质量测定，峰1的相对分子质量为2 333.0，与Th?T的理论分子质量2 334.85一致。故选定洗脱峰1为重组Th?T。
图3 融合蛋白的亲和层析洗脱曲线（略）
Fig 3 Elution curve of the fusion protein in His?Bind affinity chromatography
图4 Th?T的反相色谱洗脱曲线（略）
Fig 4 Elution curve of Th?T in reserved?phase chromatography
2.5 重组Th?T的药敏实验重组Th?T对4种供试菌的抗菌活性如表2所示，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及枯草芽胞杆菌的最低抑制浓度依次为1.56、25.0、3.13及6.25mg·L-1。报道[3]，thanatin对以上4种供试菌株的最低抑制浓度分别为1.56、50.6、6.33和25.3mg·L-1。由此表明，重组thanatin突变体对革兰阳性菌的抑制效果比thanatin增强了约1倍，而对革兰阴性菌的抑制效果几乎不变，这与文献报道[2]基本一致。
3 讨论
抗菌肽作为传统抗生素的替代品，具有低毒、低副作用、不易产生抗药性等优势，已成人们研究的热点之一[6]。大肠杆菌作为基因工程药物首选的表达系统，具有方法简便、表达量高、成本低廉等诸多优点[5]，特别适用于结构简单的小分子多肽类药物的大规模生产。Thanatin突变体虽然在国外研究已有报道，但还没有人在大肠杆菌中表达并纯化。本实验经过条件优化使Th?T融合蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达，纯化的重组Th?T具有较高活性，可以为进一步研究其药效、药理实验提供足够样品，同时也可为研究其他类似的抗菌肽提供研究思路。影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素很多，但能用于大量纯化的载体宿主菌培养条件的最佳组合往往是唯一的。实验中发现培养基pH值和细菌生长速率严重影响外源蛋白的表达。李会成等[7]发现所用工程菌的细胞生长期的最适pH值为6.8～7.4，基因表达的最适pH值为6.0～6.5，本实验的结论与之一致。菌体生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体，而本实验的目的是可溶性表达，故在实验中考察诱导前细菌生长时间和诱导后细菌生长时间对融合蛋白表达的影响，通过正交实验优化摸索出培养条件的最佳组合，既为大量获得可溶性融合蛋白提供了依据，也为其以后化生产提供数据。实验选取编码硫氧环蛋白pET32a作为表达载体，故融合蛋白绝大多数是可溶性蛋白。可溶性表达外源蛋白的好处是产量高、纯化方便，但融合蛋白也容易被菌体中的蛋白酶水解[8]，故实验中选择硫酸铵分级沉淀法从菌体破碎上清液中沉淀融合蛋白，这样既可以避免蛋白酶对目的蛋白的降解作用，又可以初步纯化融合蛋白，减少对后续亲和树脂的污染和非特异性吸附，从而使经His?Bind亲和层析纯化的融合蛋白具有较高的纯度。制备型反相色谱是目前大量纯化小分子多肽最常用的方法之一，实验中使用此方法得到高纯度的重组Th?T，并测定了分子质量，但最大的不足是成本较高、产量低。因此，虽然本研究纯化了样品，验证了表达产物的正确，并具有理想的生物活性，今后还需要进一步摸索出效率更高而成本低的纯化方法，为开发新型抗生素替代品奠定基础。
表2 重组Th?T的抗菌活性（略）
Tab 2 Antibacterial activity of recombinant Th?T
注：+为细菌生长，－为细菌不生长,±为细菌介于生长和不生长之间
【参考文献】
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