Smad4、Smad7在慢性GVHD狼疮肾炎模型小鼠肾组织的异常表达
【摘要】 目的：初步探讨Smad4、Smad7蛋白在慢性移植物抗宿主病（GVHD）狼疮肾炎（LN）模型小鼠肾组织表达的变化及意义。方法：（C57BL/6J×DBA/2）F1代杂交鼠12只随机分为模型组和正常对照组，于12周处死，采用RT?PCR研究各组肾组织Smad4、Smad7mRNA表达水平，应用免疫组织化学方法检测Smad4、Smad7蛋白在肾脏的定位表达，并观察各组小鼠24h尿蛋白排泄量。 结果：模型组和正常对照组小鼠肾组织均检测到Smad4、Smad7蛋白及mRNA的表达，模型组Smad蛋白及mRNA的表达均显著高于正常对照组（P<0.05）；模型组24h尿蛋白排泄量显著高于正常对照组（P<0.05）。结论：Smads信号通路的异常可能参与LN的发生。
【关键词】 移植物抗宿主病；狼疮肾炎；Smad蛋白；小鼠
狼疮肾炎（lupus nephritis,LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者最常见和最严重的并发症之一，病理改变具有多样性及非均一性，以肾小球、血管、肾小管及其间质损害为特征，急性或慢性进展为肾脏纤维化甚至肾功能衰竭，是SLE患者的主要死因之一。肾脏纤维化不仅是各型LN进展到终末期的共同病理表现，而且也是患者病情的重要反映指标，其主要的发生机制与肾小管上皮细胞转分化(transdifferentiation，EMT)、细胞外基质（ECM）沉积以及细胞内多种促纤维化信号途径被激活等有关。近年来许多研究结果表明，Smads信号通路与众多促纤维化信号途径（如TGF?β、AngⅡ、CTGF、MMP/TIMP等）之间存在交叉对话（cross?talk），该通路的功能失调在肾脏纤维化的发生发展中起着中心作用[1?2]，因此本研究以Smads蛋白作为切入点，观察Smad4、Smad7蛋白及其mRNA在移植物抗宿主病（GVHD）狼疮样小鼠肾组织表达的变化，初步探讨Smads蛋白是否参与介导GVHD狼疮样小鼠LN的发生发展。
1 对象与方法
1.1 研究对象8～10周龄的雌性（C57BL/6J×DBA/2）F1代杂交鼠和6～7周龄雌性DBA/2小鼠均购自中山大学医学动物中心，体重(20.17±1.20)g，饲养于东南大学医学院SPF级动物房。
1.2 模型的建立与分组参照[3]，根据完全随机设计的原则，将8～10周龄的雌性（C57BL/6J×DBA/2）F1代杂交鼠分为模型组（A组）和正常对照组（B组），每组6只。取DBA/2小鼠脾脏、胸腺和淋巴结细胞制成单细胞悬液（约60%脾细胞、30%胸腺细胞和10%淋巴结细胞），用台盼蓝染色和细胞计数板计数，保证活细胞数大于95%，调整细胞浓度为50×106，分别于1、3、7、10d静脉注射于A组F1代杂交鼠体内建成GVHD LN模型。至12周处死动物，立即取下肾脏，去掉肾包膜，一部分冻于液氮中后移至-70℃低温保存，一部分置10%中性甲醛液中固定，石蜡包埋，制成4μm厚的连续切片。
1.3 观察指标及检测方法
1.3.1 双缩脲比色法测定24h尿蛋白 将小鼠尿液经1∶5稀释后按双缩脲比色法说明书操作。
1.3.2 肾脏病理组织学检查 将小鼠肾组织切片用常规HE染色，在普通光镜下观察各组小鼠肾组织病理变化。
1.3.3 免疫组化染色检测Smad4、Smad7蛋白在肾脏的定位表达 用SP法(链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶连结法)进行免疫组化染色（试剂均购自北京中杉生物技术有限公司）。将肾组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，3%过氧化氢室温孵育10min灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原，10%正常羊血清封闭，37℃孵育15min，分别滴加1∶150稀释的Smad4及1∶100稀释的Smad7兔抗小鼠多克隆一抗，4℃孵育过夜，再依次加入生物素偶联的羊抗兔IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，各37℃孵育15min，DAB（二氨基联苯胺）染色，显微镜下控制显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片镜检。磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。结果在高倍镜（400倍）下随机选择20个肾小球和20个视野肾小管间质，根据染色面积和强度按下列方法进行半定量评分：0，无染色或微弱染色；1，染色面积＜25%；2,染色面积在25%～50%之间；3,50%<染色面积≤75%；4,染色面积＞75%。
1.3.4 RT?PCR分析各组肾组织Smad4、Smad7mRNA表达水平 （1）总RNA提取：从-70℃低温冰箱中取出肾组织迅速称取100mg，加入TRIzol（深圳晶美公司）匀浆提取总RNA。取5μl总RNA进行甲醛变性凝胶电泳，紫外灯下观察28、18s条带清晰提示RNA完整无降解。（2）逆转录反应体系：用RT?PCR试剂盒（日本TaKaRa）操作。在PCR管中依次加入10×RT缓冲液1μl、 MgCl2（25mmol·L-1）4μl、Oligo dT 1μl、dNTPs（10mmol·L-1） 2μl、RNA酶抑制剂0.5μl、AMV逆转录酶1μl和总RNA 5μl，放入Gene Amp Sys2tem 2400 PCR 扩增仪中，42℃逆转录50min，99℃灭活AMV逆转录酶5min，5℃ 5min，所得cDNA于-20℃保存用于PCR扩增。（3）PCR扩增：GAPDH内参照引物用DNA Club软件设计，Smad4及Smad7引物分别参照文献[4?5]由上海生工生物工程公司合成。序列如下：Smad4上游引物为5′?CAACACCCGC CAAGTAATC?3′，下游引物为5′?GACCCAAACGTCAC CTTCA?3′，产物为649bp；Smad7上游引物为5′?TCCT GCTGTGCAAAGTGTTC?3′，下游引物为5′ ?AGTAAGG AGGAGGGGGAGAC?3′，产物为164bp； GAPDH上游引物为5′?GTGGGC CGCTCTAGGCACCAA?3′，下游引物为5′?CTCTTTGTATCACG CACGATTTC?3′，产物为452bp。Smad4 PCR反应体系:5×PCR缓冲液 5μl、MgCl2（25mmol·L-1）0.5μl、dNTPs（10mmol·L-1）0?25μl 、上游及下游引物（25μmol·L-1）各0.5μl，cDNA模板3.5μl、 TaqDNA聚合酶（5U·μl-1）0.5μl，补足双蒸水至25μl；Smad7 PCR反应体系:5×PCR缓冲液5μl、MgCl2（25mmol·L-1）0.5μl、dNTPs（10mmol·L-1）0.25μl 、上游及下游引物（25μmol·L-1）各1μl、cDNA模板2.5μl、 TaqDNA聚合酶（5U·μl-1）0.5μl，补足双蒸水至25μl。PCR 扩增仪扩增,Smad4条件为：94℃预变性2min,94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸1min,共循环30 次，72℃终末延伸7min；Smad7改退火温度为52℃，其余与Smad4相同。（4）产物检测：Smad4、Smad7扩增产物在1 %琼脂糖凝胶中以110V 电压电泳50min，在含0.5mmol·L-1溴乙锭的溶液中染色20min。于Image Master VDS 凝胶扫描仪上成像,用Totallab V 2.01 凝胶图像分析软件进行面积灰度扫描，以待检指标与GAPDH吸光度的比值来表示其相对含量（目的基因相对表达量=目的基因条带吸光度/GAPDH基因条带吸光度）。1.4 统计学分析实验数据用x-±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析(q检验)，免疫组化评分结果用成组设计两样本比较的秩和检验，也可编秩后对秩次进行单因素方差分析，检验水准确定为P<0.05。以上结果均用SAS 8.2统计软件处理。
2 结 果
2.1 各组小鼠24h尿蛋白检测结果GVHD狼疮样小鼠于首次注射淋巴细胞后第8周出现尿蛋白,A组小鼠24h尿蛋白总量在8、10和12周均显著高于B组小鼠（P<0.05）。见表1。表1 各组小鼠24h尿蛋白检测结果
2.2 肾组织病理检查结果A组小鼠肾组织大多肾小球系膜细胞和内皮细胞增生，系膜区明显增宽，大量基质沉积，可见部分硬化的肾小球；肾小管呈多灶性萎缩，管腔内可见大量蛋白管型；间质中有大量单个核细胞浸润和基质沉积。见图1。2.3 LN小鼠肾组织Smad4、Smad7表达的变化
2.3.1 免疫组化半定量分析结果 小鼠肾组织Smad4、Smad7蛋白主要表达在皮质肾小管上皮细胞内，肾小球表达弱于肾小管，髓质肾小管仅有少许分布。Smad4、Smad7蛋白表达A组较B组均明显增强（P<0.05）。见表2及图2、3。
2.3.2 RT?PCR半定量分析结果 Smad4、Smad7 mRNA表达A组与B组比较差异有显著性（P<0.05），见表3、图4。小鼠肾组织大多肾小球系膜细胞和内皮细胞增生，系膜区明显增宽，可见部分硬化的肾小球,间质中有大量单个核细胞浸润表2 各组GVHD小鼠肾组织免疫组化的半定量
3 讨 论
慢性GVHD LN小鼠模型是国际公认并被广泛应用的LN小鼠模型，病变类似人类SLE，按WHO的LN形态学分类，LN小鼠模型主要表现为增生型肾小球损害[3]。本实验结果显示，自首次注射淋巴细胞后第8周开始，GVHD小鼠24h尿蛋白量逐渐升高，第12周末达到高峰，病理组织学检查发现部分肾小球硬化、肾小管萎缩以及间质大量单个核细胞浸润和基质沉积，表明我们已成功构建了GVHD LN小鼠模型。Smads蛋白是TGF?β的下游信号传导蛋白，目前发现脊椎动物有9种不同的Smads，根据其结构和功能不同可分为受体激活型Smad（R?Smads）、通用型Smad（Co?Smads）和抑制型Smad（I?Smads）3个亚家族。Smad4是Co?Smads，可与磷酸化的R?Smads结合成复合物，在Smads信号传导通路中起着信号的正向传导放大作用，Smad7是I?Smads，通过竞争性地与Ⅰ型受体结合而抑制R?Smads蛋白磷酸化和信号传导复合物的形成，起着自身负调控作用[4]。以往的研究均表明，Smad4对Smads信号通路依赖型靶基因的激活至关重要，它是目前在哺乳动物中发现的唯一Co?Smads。Goto等[6]用酶联免疫吸附法比较了肾小球肾炎小鼠的肾小管间质纤维母细胞（ICGN?TIFs）和正常小鼠的肾小管间质纤维母细胞(ICR?TIFs)中TGF?β1的表达水平，结果发现TGF?β1的表达及其活性均没有明显差异，而诱导ICGN?TIFs胞浆内Smad4蛋白表达升高后，发现细胞对TGF?β1的敏感性显著增强，Smad2/3?Smad4聚合物形成能力及核转位率也明显提高，从而增强了TGF?β1的信号转导。这提示当肾系膜细胞以及肾小管间质纤维母细胞中Smad4蛋白表达异常增高后，可能通过增强TGF?β1的信号转导从而促进肾脏纤维化。Smad7在其他肾脏疾病中的表达有学者作过研究，但结果不尽相同。Fukasawa等[7]在大鼠肾梗阻模型（UUO）研究中发现，随着UUO大鼠肾小管间质纤维化的进展，Smad7mRNA表达水平不断增高，而蛋白表达水平却降低，进一步研究显示，可能由于Smad的泛素调节因子1、2（Smad ubiquitin regulatory factors Smurfs），也称E3泛肽酶（E3 ubiquitin ligases）表达水平增高，导致Smad7蛋白的降解和泛肽化活性显著增强。Uchica等[8]在肾小球膜增生性肾炎大鼠模型（anti?Thy?1 nephritis）中发现Smad7在肾小球表达降低，但 Ostendorf等[9]却在相同的模型中得到了相反的结论。我们的实验结果显示，慢性GVHD LN小鼠及B组小鼠肾组织均检测到Smad4及Smad7mRNA和蛋白的表达，LN小鼠肾组织Smad蛋白及mRNA的表达均显著高于B组（P<0.05）。对我们实验结果的可能解释如下：（1）以往我们的研究[10]在LN肾组织中TGF?β的表达水平显著增高，Smad4作为TGF?β下游信号传导的承担者，随着肾脏纤维化病程不断恶化和TGF?β表达增强而增强；另外，Smad7基因启动子区包含1个Smad3?Smad4复合物的结合序列（GTCTAGAC），因此TGF?β和Smad4表达水平增强会显著上调Smad7的表达；（2）近来研究发现，Smads信号通路的抑制物（如：SnoN和Ski等）在纤维化的肾脏中表达水平降低[11]，提示Smads抑制物表达的降低可能是肾脏纤维化中Smads表达增高的重要机制；(3) Smad7在LN肾组织中的表达增强，但内源性Smad7的表达却不足以抑制纤维形成反应，因为TGF?β对内源性Smad7表达的刺激不足以克服其活化R?Smads而产生的纤维化效应，对此的可能解释是Smad7表达的基本水平（即使受到刺激时）能阻止R?Smads介导TGF?β效应，这一监控形成了一个内源性Smad7表达的刺激阈值，超过这一阈值则发生纤维形成反应[12]，而可能通过一个适当的载体系统（如：转染Smad7基因[13]）使Smad7异位表达，这可能是肾脏纤维化的一种手段。综上所述，在LN肾脏纤维化发生的分子机制中有Smads蛋白的参与，而且不同类型的Smads分子承担的作用不同，以Smads蛋白作为靶向治疗目标调节其正负向调控蛋白的平衡表达，将为LN的治疗提供新的手段。
【】
[1]MARIE C H,DAVID A.The comparative role of activator prot?ein1 and Smad factors in the regulating of TIMP?1 and MMP?1 gene expression by transforming growth factor β1[J].J Biol Chem,2003,278(12):10304?10313.
[2]VITA R,LOPEZ S,ESTEBAN,et al.Angiotensin Ⅱ activates the smad pathway in vascular smooth muscle cells by a transforming growth factor?[beta]?independent mechanism[J].Circulation,2005，111:2509?2517.
[3]阳晓，叶任高，陈伟英，等.慢性移植物抗宿主病狼疮样肾炎小鼠模型的研制[J].中华肾脏病杂志，2000，16（5）：277?281.
[4]VRLJICAK P,MYBURGH D,RYAN A K,et al.Smad expression during kidney development[J].Am J Physiol Renal Physiol,2004,286:F625?F633.
[5]徐新保，冷希圣，杨晓，等.反义Smad4基因转染对抗昆明小鼠肝脏纤维化发展的效果观察[J].中华普通外科杂志，2004，19（1）：50?52.
[6]GOTO Y,MANABE N,MIYAMOTO H,et al.Augmented cytoplasmic Smad4 induces acceleration of TGF?β1 signaling in renal tubulointer?stitial cells of hereditary nephritic ICGN mice with chronic renal fibrosis;possible role for myofibroblastic differentiation[J].Cell Tissue Res,2004,315:209?221.
[7]FUKASAWA H，YAMAMOTO T，TOGAWA A,et al.Down?regulation Smad7 expression by ubiquitin?dependent degradation contributes to renal fibrosis in obstructive nephropathy in mice[J].Medical Sciences,2004,101:8687?8692.
[8]UCHICA K,NITTA K,KOBAYASHI H,et al.Localization of Smad 6 and Smad 7 in the rat kidney and their regulated expression in the anti?Thy?1 nephritis[J].Mol Cell Biol Res,2000,4(2):98?105.
[9]OSTENDORF T,KUNTER U,van ROEYEN C,et al.The effects of platelet derived growth factor antagonism in experimental glomerulonephritis are independent of the transforming growth factor?beta system[J].J Am Soc Nephrol,2002,13(3):658?667.
[10]王美美，朱小霞.BXSB狼疮小鼠肾组织TGF?β1异常表达及甲泼尼龙干预作用[J].临床药与治疗学，2005，10（7）：799?803.
[11]YANG J,ZHANF X,LI Y,et al.Down?regulation of Smad transcriptional corepressors SnoN and Ski in the fibrotic kidney:an amplification mechanism for TGF?β1 signaling[J].J Am Soc Nephrol,2003,14:3167?3177.
[12]SCHNAPER H W,HAYASHIDA T,PONCELET A C.Its a Smad world:regulation of TGF?beta signaling in the kidney[J].J Am Soc Nephrol，2002，13(4):1126?1128.
[13]HOU C C,WANG W S,HUANG X R,et al.Ultrasound?microbubble?mediated gene transfer of inducible Smad7 blocks transforming growth factor?β signaling and fibrosis in rat remnant kidney[J].Am J Pathol,2005,166:761?771.
