参麦注射液对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后学习及记忆能力的改善作用
【摘要】 目的：探讨中药参麦注射液对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）后学习和记忆能力的改善作用。方法：7日龄SD大鼠随机分为参麦注射液干预组、胞二磷胆碱干预组、生理盐水干预组、假手术组和正常对照组5组。前3组均在成模后当日开始每组每只分别给予参麦注射液、胞二磷胆碱和生理盐水腹腔注射干预，1次·d-1，连续14d。其余两组不做处理。应用Y?型电迷宫对各组第60及90日龄实验大鼠测试学习能力，并于24h后（第61、91日龄）复测，检测各实验大鼠24h记忆保持能力。结果：经过参麦注射液和胞二磷胆碱分别干预后，其学习能力及24h记忆能力与生理盐水干预组比较有明显改善（P＜0.05），参麦注射液组与胞二磷胆碱组之间也有统计学差异（P＜0.05）。结论：参麦注射液和胞二磷胆碱均可改善大鼠HIBD后的学习和记忆能力，前者优于后者。
【关键词】 参麦注射液；新生大鼠；缺氧缺血性脑损伤；学习；记忆
新生儿缺氧缺血性脑损伤（HIBD）是威胁新生儿生命以及导致患儿神经系统后遗症的严重疾病之一，目前临床的主要是对症处理，但对中重症患儿的疗效并不尽如人意，常伴有以神经精神行为障碍为主的多种后遗症。临床研究已证实，参麦注射液(Shenmai injection) 能改善成人心脑血管血流量、降低心脑血管耗氧量、改善脑细胞功能，但在儿科尚缺乏可信资料。本实验按照Rice等[1]方法对新生SD大鼠缺氧2h以造成中重度HIBD模型，并通过胞二磷胆碱（CDPC）、参麦注射液等分别干预，应用Y?型电迷宫对各组第60及90日龄实验大鼠测试学习能力，并于24h后复测，检测各实验大鼠24h记忆保持能力，以探讨参麦注射液对HIBD的疗效，为中医药防治新生儿HIBD的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物出生7d同窝SD大鼠，雌雄不拘，体重（12.15±2?30）g，由东南大学医学院实验动物中心提供。
1.2 主要药物与仪器CDPC钠注射液（张家港市制药厂），参麦注射液（深圳三九制药厂），液氮（南京大学冷冻厂）；Y?型电迷宫（张家港医疗仪器设备厂）。
1.3 实验方法
1.3.1 新生大鼠HIBD模型制作 按照Rice等[1]方法选出生7d的SD大鼠，乙醚吸入麻醉。取颈正中切口，游离左侧颈总动脉，以4?0号线结扎，缝合切口后放回原饲养环境中恢复2～3h，然后置37℃恒温2000ml 密闭容器中，以2L·min-1的速度输入8% O2和92% N2混合气体，持续2h（以建立中重度HIBD模型），取出后置于原饲养环境中。
1.3.2 动物分组及给药方法 共40只大鼠，采用分层随机方法将同一窝别大鼠随机分配到以下5组当中，每组8只，各组分别于生后第60、61天以及第90、91天进行Y?型迷宫测试：（1）正常对照组(Control组)。每只鼠仍回原饲养环境、由原母鼠喂养，幼鼠不做任何处理。（2）CDPC组。各鼠完成HIBD后仍回原饲养环境、原母鼠喂养，分别于即刻（0h）及之后每天的同一时刻腹腔注射CDPC 0?015ml加生理盐水0.085ml（总容量为0.1ml），1次·d-1，共14d。（3）参麦注射液组(HIBD?1组)。各鼠完成HIBD后仍回原饲养环境、由原母鼠喂养，分别于即刻（0h）及之后每天的同一时刻腹腔注射参麦注射液0?08ml加生理盐水0.02ml（总容量0.1ml），1次·d-1，共14d。（4）生理盐水组（HIBD?3组）。各鼠完成HIBD模型后仍回原饲养环境、由原母鼠喂养，每日给予生理盐水0.1ml腹腔注射，1次·d-1，共14d。（5）假手术组（Sham组）。幼鼠仅进行手术游离左侧颈总动脉，但不结扎、不缺氧、不进行其他处置，术后仍回原饲养环境、由原母鼠喂养。
1.3.3 Y?型迷宫实验学习测试 按照实验设计，所有幼鼠均与母鼠一起饲养至21d断乳，然后于同一环境中由专人喂养，至第60、61天以及第90、91天分别进行Y?型迷宫测试。Y?型等臂电迷宫臂长30cm，高15cm，宽15cm，每臂末端有15W信号灯示安全区，箱底铜栅间隔4mm。电流强度0.7mA，选用电压（50±5）V，电击延时5s。（1）学习训练及测试：实验开始时，将动物放入Y?型迷宫中的任一臂并将该臂设为起步区，让大鼠静置适应3～5min，注意观察第0～3min大鼠适应环境行为（开场行为），主要是寻觅活动度、后腿站立次数、排粪便粒数及理毛次数。然后将其它任一臂的信号灯打开作为条件信号，示安全区，指示动物应跑向该臂，经5s延时后，不亮灯两臂及连接区通电（50±5）V作为非条件刺激。当动物逃避电击至安全区后切断电流，此时灯光仍持续约30s使动物产生记忆，然后熄灯休息45s即完成一次测试。凡通电时动物直接从起步区跑向安全区为“正确反应”，反之为“错误”。达到学会标准为连续10次训练中有9次正确，记录每一动物达标前所需测试数，表示其学习获得能力，以此作为学习快慢的客观指标。若尝试次数超过40次仍然不能达标则不再测试，并以40次为最大值计数。（2）记忆保持及再现（retrieval）测试：上述各实验大鼠休息24 h后再次同法测试，检测记忆保存情况，即在连续10次测试中正确反应尚保持多少，以记忆保持的百分数表示。
1.4 统计学处理实验所得数据以尝试次数的x-±s表示，采用方差分析及组间两两q检验进行统计学处理。分析软件使用SAS v9.1。
2 结 果
2.1 开场行为（open field behavior）观察如表1所示，第60、90天各组动物环境适应行为显示，除第60天粪便粒数（P=0.054）外，其余各相同观察内容比较，组间均有统计学差异（P＜0.05）。组间两两q检验显示，3min内实验大鼠后腿站立次数、理毛次数两项内容分别比较，HIBD?3组和CDPC组与其他3组之间均有统计学差异（P＜0.05），而CDPC组与HIBD?3组实验大鼠上述项目的比较无显著性差异（P＞0.05） 表1 开场前3min内环境适应行为情况比较
2.2 Y?型迷宫实验如表2所示，在第60、61天阶段，HIBD?3组大鼠在Y?型迷宫中达到学会标准所需要的训练次数均多于其他4组，经q检验显示有统计学差异（P＜0.05），其24h 记忆率低，与Control、Sham、HIBD?1组分别比较均有显著性差异（均P＜0.01），而与CDPC组之间无统计学差异（P＞0.05）；HIBD?1组与CDPC组之间比较，实验大鼠在Y?型迷宫中达到学会标准所需要的训练次数以及24h记忆率均有统计学差异（均P＜0?05）。在第90、91天阶段，大鼠在Y?型迷宫中达到学会标准所需要的次数及24h记忆率，HIBD?3组与其他4组经q检验显示均有统计学差异（均P＜0.05），HIBD?1组与CDPC组比较亦均有统计学差异（均P＜0.05）。表2 各组大鼠学习及记忆情况
3 讨 论
HIBD是威胁新生儿生命以及导致患儿神经系统后遗症的严重疾病之一，其发病机制复杂，有多种因素参与。该病目前总体效果不令人满意，关于各种治疗的预后报道甚少。许多研究表明，神经元死亡分为两个阶段。神经元的第二死亡阶段发生在缺氧缺血数小时以后，称为选择性神经元死亡，现多认为该阶段细胞死亡主要是凋亡[2?3]。由于脑内对缺氧缺血最敏感的区域是海马，尤其是CA1区，因此海马区是延迟性神经元死亡（delayed neuronal death，DND）最主要的区域。许多研究还表明，海马不仅是学习记忆的关键部位，而且作为学习记忆的相关脑区，海马处突触界面结构是敏感易变的，容易受突触前传入信号、药物、机体内外环境变化等多种因素影响而发生可塑性变化[4]，这就为临床进行药物研究提供了可行性。临床观察发现，一些HIBD患儿经过积极救治后临床症状和体征明显改善，但是在以后的随访中发现，这些患儿的学习记忆能力、空间认知能力以及本体感觉能力不同程度落后于正常同龄儿，提示在HIBD的治疗过程中，海马区功能的恢复并不理想。既然海马区是发生选择性DND的主要部位，而DND的形式是细胞凋亡，理论上就应该有较长时间窗可以采取相应的措施以减轻甚至避免新生儿HIBD所引起的一系列损害。本实验HIBD模型采用Rice等[1]方法制作，多年来该法在国际上广泛采用，切实可靠。本科实验室已有多年根据Rice法制作新生儿HIBD模型的经验，所制作的模型能造成与被结扎单侧颈总动脉的成年大鼠大脑相同部位的皮质坏死及局部脑水肿，结果与报道[1]一致。在以往的实验中，本实验室研究人员还观察了持续缺氧不同时间所引起的不同程度脑损伤之间的关系，通过大体标本以及即刻早基因(IEGs)的研究发现，缺氧1h以下大鼠多数出现轻度缺血性神经元改变，在缺氧3h以上实验动物多数以重度缺血性神经元改变为主。这与文献报道[3]的持续缺氧180min以上动物多数出现严重脑组织损伤相一致，故本实验选择缺氧2~2.5h，以建立中到重度缺血性神经元损伤模型。CDPC属于影响脑细胞代谢类药物，主要通过直接或间接地影响核酸、蛋白质以及脂质代谢的调节而刺激神经生长、保护脑细胞抗缺氧能力。CDPC是合成卵磷脂的前体，而卵磷脂是细胞膜的关键成分。当外源性给予时，CDPC是一种神经保护剂和膜磷脂生物合成的媒介，可通过抑制卵磷脂的分解而预防游离脂肪酸的升高，保护脑组织免受缺血损害，还可以进一步恢复脑缺血后受损的膜结构的完整性[5]。实验证明[6?7]，CDPC可增加中枢神经系统的去甲肾上腺素和多巴胺水平，没有明显副作用，非常安全。由于目前HIBD发病机理复杂且无特效治疗，故CDPC仍然是目前临床上治疗新生儿HIBD的主要药物之一，“九五”攻关项目新生儿HIBD协作组所拟定的HIBD治疗方案中，将其列为常规治疗药物之一。本实验结果也证实，新生HIBD实验大鼠模型经过CDPC干预后，其行为预后特别是24h记忆率有明显改善（P＜0.05）。中药是我国的瑰宝，多年来，中药之间搭配应用，通过相互之间的作用取长补短而发挥多个环节的作用，更符合疾病发生，能达到理想治疗效果。参麦的药物组成为红参、麦冬提取物（有效成分为人参皂甙、麦冬皂甙、麦冬黄酮及微量人参多糖和麦冬多糖），其药物含量（每ml含有效成分）为人参皂甙3.5~5.0mg、麦冬皂甙0.06mg、麦冬黄酮0.1mg，每1ml注射液相当于生药红参0.1g、麦冬0.1g。医学单味分析认为，红参能够抑制线粒体脂质过氧化反应，清除体内引进生成的活性氧；也有报道认为能改善脑细胞功能。麦冬能够提高小鼠在常压下耐缺氧缺血的能力，并促进修复实验动物心肌细胞缺氧性亚微结构的改变,还可显著对抗脑垂体后叶素引起的心脑血管血流量变化、降低心脑血管耗氧量、提高大脑皮层功能。其组方后在成人临床应用多年，功效显著[8?10]，故本实验采用改组方药进行实验，了解其在新生儿HIBD后神经保护作用的远期疗效。本实验结果显示，经过参麦注射液干预14d后的 HIBD大鼠模型，其在开场行为比较中无论是60d还是90d组，动物在后腿站立次数、理毛次数方面和未经干预的HIBD大鼠模型比较均有显著统计学差异，而且与CDPC组之间也有统计学差异，提示参麦干预后动物的主动性探索能力均有改善；Y?型迷宫实验中，在出生后第60、61天和90、91天，参麦组在达到学会标准所需要的训练次数以及24h记忆率两方面，与未经干预的模型组相比均有统计学差异，而且CDPC组与参麦组之间比较也有统计学差异。这些均表明，经过上述两种药物干预可以改善HIBD大鼠的学习记忆能力，但是参麦更优。参麦能改善HIBD后动物的行为探索能力和学习记忆能力，这可能与参麦中含有人参皂甙有关。人参皂甙不仅可以保护缺氧缺血的脑组织[11?12]，而且可以抑制海马锥体细胞突触小泡以及皮质神经元谷氨酸的释放[13]。临床对HIBD新生儿的救治不仅在于早期及时正确的治疗干预，更要注重早期持续有效的连续性干预，以改善行为预后，这直接关系到患儿以后的生存质量。通过本实验，我们进一步认识到在临床救治工作中，应该有意识做好神经损伤的功能恢复，从而提高HIBD患儿的生存质量。
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