虎杖中白藜芦醇对心肌细胞的电生理效应及其作用机制
【关键词】 机制
基金项目：张家口市技术研究与指导计划项目（编号：060129）
白藜芦醇(Resveratrol ) ，化学名称为 3，4′，5?三羟基二苯乙烯(trans?3，4′，5?trihydroxystilbene)，是一类主要存在于葡萄等植物中的多酚类化合物，经不断研究发现，目前至少在72种植物中含有白藜芦醇[1]，在72 种被发现的植物中，以中药虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)中含量最高[1，2]。目前越来越多的学者认为，白藜芦醇可降低心血管疾病的发生[3，4]。
1 白藜芦醇对心肌细胞的电生理效应
目前，关于白藜芦醇对心肌细胞作用的研究较少，已报道的主要集中在其对窦房结和乳头肌的作用的研究上。
1.1 对窦房结(Sino?atrial node)的电生理效应
窦房结位于右心房接近上腔静脉入口处，呈长椭圆形，含有起搏细胞和神经纤维，能有节律地发生兴奋，是心脏正常起搏点。刘政等首先应用经典玻璃微电极的方法研究了白藜芦醇对家兔窦房结起搏细胞的电生理效应并探讨其作用机制[5]。研究发现：白藜芦醇能够抑制家兔窦房结起搏细胞的自发活动，此效应可能与其抑制钙离子内流有关，但该机制并无NO 参与。钙离子内流在窦房结起搏细胞的0 期除极过程中发挥着主要作用[6]，这一点已得到广泛认同。因此他们推测白藜芦醇对 APA、Vmax、VDD 及 RPF 的抑制作用可能归因于其抑制钙离子内流。
1.2 对乳头肌(papillary muscles)的电生理效应
赵娟等应用标准玻璃微电极技术，观察了白藜芦醇对离体豚鼠乳头肌的电生理效应。结果显示：（1）Resveratrol（30～120 μmol/L）可剂量依赖性地缩短乳头肌细胞的动作电位时程（APD）；（2）对部分去极化的乳头肌，Resveratrol（60 μmol/L）使 APD由缩短，使动作电位幅值（APA）下降，超射值下降，0期最大上升速度（Vmax）下降；（3）应用 L 型钙通道开放剂 Bay K8644(0.25 μmol/L)，可拮抗 Resveratrol（60μmol/L）的电生理效应；（4）钾通道开放剂四乙基氯化铵（TEA，10mmol/L），不能阻断 Resveratrol（60 μmol/L）的电生理效应；（5）预先应用一氧化氮合酶抑制剂 L?NAME（1 mmol/L），对Resveratrol的上述效应无影响。由此他们认为Resveratrol对乳头肌的电生理效应与其抑制钙离子内流有关，并且此作用机制中似乎并无 NO 的参与[7]。
2 白藜芦醇对心肌细胞电生理效应的作用机制
2.1 抑制钙离子内流
白藜芦醇对心脏的各种电生理效应都提示其主要是通过抑制钙离子内流来发挥作用的[8]。河北医科大学生理室为明确白藜芦醇对钙离子通道的作用和机制，应用全细胞膜片钳技术研究了白藜芦醇对大鼠心室肌细胞 L?钙通道电流（ICa?L）的影响。研究发现：白藜芦醇（10，20，40 μmol/L）可浓度依赖性地降低电压依赖性的 ICa?L的峰值并上移 I?V 曲线；白藜芦醇可以使 ICa?L的稳态激活曲线右移，而对 L?型钙通道的稳态失活曲线无影响；白藜芦醇明显使复活曲线右移，从而使 ICa?L从失活状态下恢复明显减慢。有研究报道指出：白藜芦醇可能通过抑制钙离子内流来发挥作用[7]。刘政等用激光共聚焦观察白藜芦醇对心室肌细胞内游离钙浓度的影响，发现在正常台氏液和无钙台氏液中，白藜芦醇(15～60 μmol/L)浓度依赖性地降低细胞内钙浓度；此外，白藜芦醇可降低钙波的传播速度和持续时间，并最终阻断钙波[9]。张利萍等用全细胞膜片钳技术研究发现：白藜芦醇抑制钙通道激活并使钙通道从失活状态下恢复减慢从而抑制钙离子内流。
陈鹏等研究后认为白藜芦醇甙对细胞静息钙浓度无明显影响，但可显著降低凝血酶激活后的胞浆钙浓度，既减少外钙内流也抑制内钙释放；维拉帕米也可明显降低血小板胞浆钙浓度，但只抑制钙内流[10]。
我们知道，白藜芦醇在虎杖中含量最高，金春华等通过虎杖苷（PD，白藜芦醇的糖苷形式）对大鼠心肌细胞的研究表明，其强心作用可能由于它能增加心肌细胞内的钙离子浓度所致，实验中他们发现PD可以明显增加单个心肌细胞中的游离钙离子浓度。 还可能具有增强钙泵或者 Na+?Ca2+ 交换蛋白的功能，使舒张期胞浆中的 Ca2+ 能更快、更有效地被肌浆网摄回或排出细胞外。PD 的这种效应，使其在理论上具有比洋地黄类强心甙更优越的强心功能[11]。这一结果与河北医科大学的研究结果相反，因金春华所用PD为第一军医大学化学教研室制备纯化，这是否与结果有一定关系，还有待于进一步研究。
2007年10月李蓟龙：虎杖中白藜芦醇对心肌细胞的电生理效应及其作用机制第5期2007年10月河北北方学院学报（医学版）第5期2.2 抑制PKC激活的信号转导途径
Slater SJ等研究后认为，白藜芦醇通过增强内皮的完整性来实现抗动脉硬化和心血管病的作用，这项研究表明，白藜芦醇的这些作用可能源于对PKC的调节（白藜芦醇对PKC同工酶体外活性的影响）。研究发现，白藜芦醇可以抑制PMA和二脂酰甘油（DAG）（IC50约为2mM）对PKCα亚型的诱导，而PKCα亚型可激活Ca2+活性。对传统的PKCβI亚型，白藜芦醇也有抑制作用，然而对新发现的PKCε亚型和非典型的PKCδ亚型却未发现这种影响。研究发现白藜芦醇对PKCα亚型活性的抑制表现为对PMA的竞争性抑制，而对Ca2+和磷脂酰丝氨酸表现为非竞争性作用，因此认为白藜芦醇与PMA竞争性结合C1区域。同时，研究发现白藜芦醇可结合于PKCα亚型的的C1A 和C1B区域，也支持这一观点。PMA和二脂酰甘油（DAG）有与此类似的作用，白藜芦醇与C1区域的交互作用可诱导PKCα亚型与脂质泡膜相结合，虽然这并不能引起PKC活性。综上所述，这一结果提示白藜芦醇可能抑制PKC的活性，进而影响与此相关联的信号[12]。此外，白藜芦醇对这些信号网络的作用可因细胞定位和调节PKC同工酶而预示不同。
但是，也有研究表明白藜芦醇诱导的细胞表现型依赖于细胞内的钙和酪氨酸蛋白激酶活性以及肌动蛋白微丝微管的集聚，但与蛋白激酶C (proteinkinase C，PKC)活性无关[13]。
2.3 抑制TPK激活的信号转导途径
蛋白酪氨酸激酶(TPK)或蛋白激酶C(PKC)是信号转导通路中重要的信号分子，他们能催化ATP上的磷酸基转移到蛋白质氨基酸的残基上，使其残基磷酸化，经过酶促反应控制细胞的增殖和分化。TPK能激活ATP末端磷酸，使底物蛋白质的酪氨酸残基磷酸化。酶动力学实验表明，对TPK的抑制作用属非竞争性抑制。TPK在调控细胞信息传递方面有着重要作用。同样，他们也可诱导和加速耐药糖蛋白P?gp的磷酸化而导至MDR的发生和发展。因此，TPK或(和)PKC就成为一个非常重要的MDR逆转靶点[14]，天然白藜芦醇可分别抑制TPK和PKC活性，通过与酶底物竟争而影响细胞的生长、增殖和分化[15]。Rong Y等研究后发现白藜芦醇对AP?1(activator protein 1) 和MAPK(mitogen?activated protein kinase)的影响通路包括其对TPK和PKC的抑制[16]。Bruder 等发现白藜芦醇显著影响牛肺动脉内皮细胞的形状和增殖，表现为信号抑制因子。河北医科大学生理室用激光共聚焦显微镜研究发现，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂(可促进酪氨酸磷酸化)能抑制白藜芦醇降低细胞内钙离子浓度的作用；并且用全细胞膜片钳技术研究发现，正钒酸钠能减弱白藜芦醇抑制ICa?L的作用。这提示白藜芦醇可能通过酪氨酸蛋白激酶途径来发挥作用。
酪氨酸磷酸酶抑制剂正钒酸钠可显著对抗白藜芦醇引起的ICa?L抑制效应。这一研究表明：白藜芦醇抑制钙通道激活并使钙通道从失活状态下恢复减慢从而抑制ICa?L；白藜芦醇对ICa?L的这种抑制作用可能与蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制有关。
2.4 NO途径
NO具有舒张血管和抗血小板聚集的特性，从长期效应看NO可诱导保护心血管系统基因的表达，并能限制致动脉粥样硬化的血浆蛋白进入血管壁，在50～100μmol/L浓度下，白藜芦醇可使得培养的肺动脉内皮细胞eNOS表达增加3倍，而在10mol/L时没有任何效果[17]，随后的实验[18]发现白藜芦醇在孵化24～72h的HUVECs中以一种浓度和时间依赖的方式上调eNOSmRNA的表达(最高可达2倍)，使得eNOS蛋白和来自于eNOS的NO的产量也同时增加，Leikert等[19]利用白藜芦醇和红酒多酚提取物获得了相似的结果，Wallerath T等[20]在随后的实验中发现在红酒提取物中，白藜芦醇是最强的刺激eNOS转录和表达的多酚类物质。红酒能促进eNOS表达的作用大部分是来源于白藜芦醇，只有少部分是来源于其他多酚类物质的作用。白藜芦醇的这种作用提示，活化的eNOS水平的升高及随后的内皮NO的释放可对抗内皮功能紊乱的发生从而支持了白藜芦醇和多酚类物质对心血管系统的长期保护作用。
白藜芦醇可能通过增加一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)，尤其是诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达，增加NO的含量，从而激活鸟苷酸环化酶(GC)，提高环磷酸鸟苷(cGMP)水平，减少钙离子内流[21]。然而，也有研究报道白藜芦醇是直接抑制钙通道或通过非?依赖途径来抑制钙离子内流的[22]。在白藜芦醇对家兔和豚鼠心肌细胞的电生理效应的实验中，预先给与一氧化氮合酶抑制剂L?NAME不能阻断白藜芦醇的作用，提示在心肌细胞上，白藜芦醇可能不是通过NO途径来发挥作用的，其中机制有待进一步研究。
2.5 雌激素样作用
白藜芦醇分子结构与合成的雌激素类化合物己烯雌酚（DES）的结构类似，并显示一定的雌激素活性，所以被称为植物雌激素[23]。实验[24]证实白藜芦醇和17β?EST都是通过抑制电压依赖性钙通道实现它们的扩血管效应，它们是通过何种途径抑制电压依赖性钙通道，目前药机制仍然是个迷，陈亮等研究后认为白藜芦醇和17β?EST对冠脉血管的舒张作用与β受体和血管壁传统雌激素受体无关，与雌激素经典核内作用途径无关，但二者的作用部分与内皮释放的NO有关，由此他们推测，有未知膜受体参与其中[25]。综上所述，白藜芦醇对心肌细胞挥着不同的电生理效应，这都可能和其抑制钙离子内流有关，但其中的详细机制还有待于进一步研究。通过对白藜芦醇的电生理效应及其作用机制的深入研究将为其在临床中的应用提供更丰富的实验依据及生理学基础。
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1 Jang MS，Cai LN，Udeani GO，et al.Cancer chemopreventive activity of resveratrol，a natural product derived from grapes/[J/].Science，1997；275：218?220
2 Tyler VE.Grape expectations (compound in grapes may fight cancer) includes related article on grape?seed extract and on echinacea/[J/].Prevention,1997,9(6):80?84
3 Frankel EN，Waterhouse AL，Kinsella JE.Inhibition of human LDL oxidation by resveratrol/[J/].Lancet，1993，341(8852)：1103?1104
4 Goldberg DM，Hahn SE，Parkes JG.Beyond alcohol：beverage consumption and cardiovascular mortality/[J/].Clin Chim Acta，1995，237(1?2)：155?187
5 Liu Z，Wang QS，Zhao J，et al.Electrophysiological effect of resveratrol on pacemaker cells in sinoatrial node of rabbits/[J/].Chin J Pharm Toxicol，2005，19(6)：407?411
6 Irisawa H，Brown HF，Giles W.Cardiac pacemaking in the sinoatrial node/[J/].Physiol Rev，1993，73：197?227
7 Zhao J，Ma HJ，Dong JH，et al.Electrophysiological effects of resveratrol on guinea pig papillary muscles/[J/].Acta Physiol Sin，2004，56(6)：708?712
8 Zhang LP，Ma HJ，Zhao J，et al.Effects of resveratrol on delayed after depolarization and triggered activity induced by ouabain in guinea pig papillary muscles/[J/].Acta Physiol Sin，2005，57(3)：361?366
9 Liu Z，Zhang LP，Ma HJ，et al.Resveratrol reduces intracellular free calcium oncentration in rat ventricular myocytes/[J/].Acta Physiol Sin，2005，57(5)：599?604
10陈鹏 ，杨丽川 ，雷伟亚.白藜芦醇甙对血小板聚集功能及内钙水平的影响/[J/].天然产物研究与开发，2005，17(1)：21?24
11金春华 ，刘杰 ，黄绪亮 ，等 .虎杖苷对心肌细胞收缩性的影响/[J/].药理学通报，2000，16 (4) ：400?402
12Slater SJ，Seiz JL，Cook AC，Stagliano BA，Buzas CJ.Inhibition of protein kinase C by resveratrol/[J/].Biochim Biophys Acta， 2003 Jan 20；1637(1)：59?69
13Bruder JL，Hsieh T，Lerea KM，et al.Induced cytoskelet al changes in bovine pulmonary artery endothelial cells by resveratrol and the accompanying modified responses to arterial shear stress/[J/].BMC Cell Biol，2001，2：1
14Jiang Z，Liu L，Fang W，et al.Local radiative treatment of hepatocellular cancer with phosphorus?32 glass microspheres to enhance the efficacy of hepatic artery chemoembolism and possibly related with MDR expressed P?glycoprotein/[J/]. World J Gastroenterol，2000，6(Suppl 3)：59
15陈聪颖，陆阳，陈泽乃.天然产物在抗癌药物发现和开发中的作用/[J/].中草药，1999;30(2)：144?147
16Rong Y，Vidya H，Daniel WK，et al.Resveratrol inhibits phorbol ester and UV?induced activator protein 1 activation by interfering with mitogen?activated protein kinase pathways/[J/].Mol Pharmacol，2001，60(1)：217?224
17Hsieh TC，Juan G，Darzynkiewicz Z，et al.Resveratrol increases nitric oxide synthase，induces accumulation of p53 and p21 (WAF1/CIP1)，and suppresses cultured bovine pulmonary artery endothelial cell proliferation by perturbing progressio through S and G2/[J/].Cancer Res，1999，59：2596?2601
18Wallerath T，Deckert G，Ternes T，et al.Resveratrol，a polyphenolic phytoalexin present in red wine，enhances expression and activity of endothelial nitric oxide synthase/[J/].Circulation，2002，106：1652?1658
19Leikert JF，Rathel TR，Wohlfart P，et al .Red wine polyphenols enhance endothelial nitric oxide synthase expression and subsequent nitric oxide release from endothelial cells/[J/].Circulation，2002，106：1614?1617
20Wallerath T，Li H，Godtel?Ambrust U，et al.A blend of polyphenolic compounds explains the stimulatory effect of red wine on human endothelial NO synthase/[J/].Nitric Oxide，2005，12：97?104
21Bradamante S，Barenghi L，Piccinini F，et al.Resveratrol provides late?phase cardioprotection by means of a nitric oxide and adenosine?mediated mechanism/[J/].Eur J Pharmacol，2003，465：115?123
22Dobrydneva Y，Williams RL，Morris GZ，et al.Dietary phytoestrogens and their synthetic structural analogues as calcium channel blockers in human platelets/[J/].J Cardiovasc Pharmacol，2002，40：399?410
23张学景，邹永，钟荣清，等.白藜芦醇的雌激素样作用及相关意义/[J/].中国新药杂志，2004，13(8)：692
24Rakici O，Kiziltepe U，Coskun B，et al.Effects of resveratrol on vascular tone and endothelial function of human saphenous vein and internal mammary artery/[J/].Int J Cardiol，2005，105：209? 215
25陈亮，尹晓华.植物雌激素与雌激素对狗离体冠状血管舒张的作用对比/[J/].高血压杂志，2006，14(6)：469?471
