红毛五加多糖对体外人食道癌细胞抑制作用

                  作者：庞向红 梁淑珍 王净 尹秀玲 孙黎 罗强 田嘉铭 薄爱华

【摘要】  研究红毛五加多糖对体外人食道癌细胞增殖的抑制作用。方法：采用肿瘤细胞的药物敏感试验（CCK?8法）测定红毛五加多糖的抑制肿瘤细胞增殖作用。结果：不同浓度的红毛五加多糖对体外人食道癌细胞增殖抑制作用不同，其中浓度为6.075mg/mL抑制效果最稳定、最持久，4.050mg/mL次之。结论：红毛五加多糖对人食道癌可能有一定防治作用。

【关键词】  五加皮 食道肿瘤 药物筛选实验 抗肿瘤

    食道癌是严重威胁着人类健康的常见癌症之一。近年来，国内外已研制出许多有效的抗癌药物，并且许多研究者已经开始关注开发天然植物中具有抗癌作用的某些活性成分。五加皮（Acanthopanax gracilistylus)为五加科落叶小灌木细柱五加的根皮,以树皮为药。主要功效为祛风湿、强筋骨、利水消肿[1]。古医书记载五加皮可用于临床骨蚀(骨瘤、骨癌)、肝积(肝癌)、溺血(肾癌)等肿瘤性疾病。徐建国等体外试验结果显示,五加皮水提液24 h 内可杀死早幼粒白血病细胞株（HL?60)[2]。单保恩等证明了五加皮提取物有较强的抗肿瘤作用[3,4]。红毛五加多糖为五加皮提取物有效成分之一，为了研究红毛五加多糖对食道癌细胞株EC?109增殖的抑制效果我们进行了本试验。

    1  材料和方法

    1.1  试验样品  红毛五加多糖由河北北方学院实验中心提供。

    1.2  细胞株  人食道癌细胞株EC?109，河北北方学院实验中心提供。

    1.3  主要试剂和仪器  RPMI Medium 1640培养基：GIBCO公司；CO2培养箱：SHELLB产品，MODEL TC2323型；倒置显微镜：XDS?1 重庆光学仪器厂。活细胞计数试剂盒?CCK?8（cell counting kit?8）试剂：上海同仁试剂有限公司。酶标仪：Stat Fax 2100 广州倍肯公司。

    1.4  试验分组  试验分7个组。其中空白对照组是不加药物的肿瘤细胞培养液，RPMI?1640；试验组分为6组，加浓度为16.2mg/mL的红毛五加多糖，试验用量分别为25μL，50μL，75μL，100μL，150μL，200μL。

    1.5  细胞培养  人食道癌细胞株EC?109细胞，在含10%胎牛血清的RPMI?1640培养液中，37℃ 5%CO2饱和湿度下培养。

    1.6  试验方法  CCK?8法检测五加皮提取成分红毛五加多糖对体外人食道癌细胞抑制作用

    设上述7个组，每组设4个重复。取对数生长期的食道癌细胞，调整细胞浓度为2.0×104/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔加100μL，每个样品4个重复。用37℃ 5%CO2孵箱孵育过夜，待细胞贴壁后，分别加入浓度为16.2mg/mL的红毛五加多糖25μL、50μL、75μL、100μL、150μL、200μL。体积不足200μL /孔的用培养液补足，超出200μL /孔的应提前吸出相应量的上清液，作用24、48、72h后，分别吸尽各孔内的上清液200μL，每孔加100μL培养基和20μL CCK?8液，再放入37℃ 5%CO2培养箱中孵育4h后，将其移出，于酶标仪下分别测定不同时段的吸光度值（OD值）,450nm为检测波长，630nm为波长,食道癌细胞增殖抑制率。

    抑制率=（1-实验组A450/对照组A450）×100%

    1.7  统计学方法  各组实验统计资料通过SPSS8.0软件进行方差分析。

    2  结果

    红毛五加多糖对体外培养人食道癌细胞抑制率结果见表1，从表中可以看出，试验组中不同浓度的红毛五加多糖对人食道癌细胞的增殖均有不同程度的抑制作用，有一定差异，但组间差异不显著（P>0.05），其中3组在不同时段的抑制率最稳定、最高。即抑制人食道癌细胞株EC?109增殖效果最好。其中24h以第2、3、4、5组抑制率较高（＞58%）；48h除第1组有所增加外，其它均有所降低，差异不显著；72h除第3组持续增高外，其它均有所下降。说明第1组48h抑制率最高，第3组在3个时相中稳定性最好，抑制率最高，第2、4组次之，第5、6组最次，但总体抑制作用较强。表1  不同浓度的红毛五加多糖对EC?109细胞增殖的影响注：与空白组比较*P<0.05

    3  讨论

    试验结果表明红毛五加多糖有抑制体外培养人食道癌细胞的作用，其中以第3组（6.075 mg/mL）效果最佳，它用量小、抑制效果好。第2、4组效果相当，但第2组以用药量小、副作用小而优于第4组。第5、6组抑制率下降可能是由于培养基少而影响结果，因用量较大不可取。因此，用于食道癌的防治以6.075mg/mL的给药量具有一定的实践意义。

    红毛五加多糖是五加科五加属红毛五加的茎皮水溶性提取物，对其抗肿瘤作用报道很多，红毛五加多糖200mg/kg能抑制S180肿瘤生长，当剂量为100mg/kg和50mg/kg时能增加小鼠和环磷酰胺所致免疫功能抑制的小鼠足垫厚度。对体外培养人白血病粒细胞K562具有严重破坏作用[5]。对肿瘤细胞生长增殖集落形成具有明显的抑制作用，其抑制作用与剂量呈显著的负相关[6]。吕小英等研究结果也显示不同剂量均能显著抑制胃癌细胞集落的形成，呈剂量效应关系，对胃癌细胞的增殖和胃癌干细胞有显著性抑制作用[7,8]。

    对于五加皮抗肿瘤作用的机制也有报道，单保恩等体外细胞活力试验证明,Age（从中药五加皮中分离纯化的一种分子量为64Kda的蛋白质，纯度达到99.15%）仅抑制肿瘤细胞增殖,并不导致细胞死亡。在Age的作用下，肿瘤细胞增殖停止在细胞周期的G0/G1期,而未见直接的细胞毒效应。Age可诱导Rb、Cdk2和Cdk4表达降低，使细胞停止增殖。由此说明Age对肿瘤细胞的作用机制是通过调节控制细胞周期的酶类而发挥作用的[9]。

    五加皮提取成分在对人食道癌细胞的体外培养抑制实验，采用的是Cell Counting Kit?8法，此方法灵敏度高、重复性好、简便、省时、安全，易于进行试验研究。由于细胞失去了神经、体液的调节，药物也未经体内吸收、分布、代谢，因此肿瘤细胞在体外和体内对药物的反应性可能存在不一致，尚需进一步进行体内试验加以确证。

【】
  1 贺兴东,钟赣生主编.临床中药手册[M].北京:人民卫生出版社,1998.109

2 徐建国.302 种传统治癌中草药水提液对HL260 细胞的诱导分化及细胞毒作用[J].山西医药杂志,1991,20（2)∶82?83

3 单保恩,李巧霞,梁文杰,等.中药五加皮的抗肿瘤作用体内外实验研究[J].中西医结合杂志,2004,24（1)∶55?58

4 单保恩,段建萍,张丽华,等.五加皮抗肿瘤活性物质Age对单核细胞产生TNF2α和IL212 的影响[J].中国免疫学杂志,2003,19（7):490?493

5 高月来，沈烈行.五加皮成分和药理作用研究进展[J].山东中医药大学学报,2000，24（5）：392?393

6 李兴玉，晁党校，魏永林.红毛五加多糖抗肿瘤的实验研究[J].甘肃学报，1998，10（3）：75?77

7 吕小英，曾令福，李由,等.红毛五加多糖对体外人胃癌细胞生长和集落形成的抑制作用[J].预防医学,2000，26（4）：453?454

8 吕小英，曾令福，吴家群,等.红毛五加多糖对体外胃癌细胞抑制作用[J].预防医学情报杂志,2000，16（1）：13?14

9 单保恩,付小梅,华正祥,等.中药五加皮提取成分抗肿瘤活性作用机理研究[J].中国中西医结合杂志,2005,25(9):825?828