中药穴位敷贴疗法对哮喘大鼠炎症反应的影响

【摘要】  【目的】观察穴位敷贴疗法对哮喘大鼠炎症反应的影响。【方法】选用Wistar大鼠33只随机分为正常组、模型组、地塞米松组及穴位贴药组；模型组以卵蛋白致敏并诱发哮喘模型，腹腔注射生理盐水，同时背部给予空白对照药物敷贴；地塞米松组在哮喘大鼠雾化后予以腹腔注射1mg/kg地塞米松，同时在背部备皮予以空白对照药物敷贴；穴位贴药组在哮喘大鼠雾化后予以腹腔注射1mg/kg的生理盐水，同时在背部备皮予以药物敷贴，穴位取大椎、肺俞、脾俞、肾俞穴。疗程结束24h内取各组大鼠肺组织观察其炎症情况，并取外周血采用酶联免疫吸附（ELISA）法比较各组大鼠白细胞介素4（IL?4）、干扰素γ（IFN?γ）的含量。【结果】模型组大鼠与正常组比较，肺组织中可见嗜酸性粒细胞（EOS）、淋巴细胞及巨噬细胞浸润增加（P＜0.01）。地塞米松组与模型组比较嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞浸润显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。穴位贴药组对嗜酸性粒细胞浸润也有显著抑制作用（P＜0.01），但对于淋巴细胞及巨噬细胞浸润无显著抑制作用（P＞0.05）。模型组大鼠外周血IL?4含量较正常组显著增加（P＜0.01），而IFN?γ含量较正常组显著降低（P＜0.01），地塞米松组及穴位贴药组中大鼠外周血IL?4含量较模型组降低（P＜0.01），但地塞米松组大鼠外周血IFN?γ含量与模型组比较无显著性差异（P＞0.05），而穴位贴药组大鼠外周血IFN?γ含量显著高于模型组（P＜0.01），与正常组比较无显著性差异（P＞0.05）。【结论】中药穴位敷贴治疗哮喘的作用可能与其能抑制肺组织嗜酸性粒细胞浸润，降低外周血IL?4含量，升高IFN?γ含量有关。

【关键词】  哮喘/穴位疗法； 肺组织/病； 疾病模型，动物； 穴，大椎； 穴，肺俞； 穴，脾俞； 穴，肾俞

    中药穴位敷贴疗法是中医外治法中一种常用的治疗方法，它是通过药物刺激人体局部穴位并借助药物的药力和热力而达到温通经络、行气化痰、散寒除湿的作用。临床上多用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎等慢性呼吸系统疾病［1］。本研究观察了穴位敷贴疗法对支气管哮喘模型大鼠外周血白细胞介素4（IL?4）、干扰素γ（IFN?γ）含量以及肺组织中嗜酸性粒细胞（EOS）、淋巴细胞及巨噬细胞浸润的影响，现报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  动物  SPF级Wistar大鼠，雄性，共33只，体质量200～250g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：0016837。

    1.2  试剂及仪器  卵蛋白(OVA)购于美国Sigma公司；地塞米松购于郑州卓峰制药厂（批号：0604213）；穴位贴药制剂（批号：20060815）及空白对照药物制剂（批号：20060829）均由广东省中医药研究所制备并提供；酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒由深圳海辉试剂公司提供；超声雾化器为汕头市粤华医疗器械厂产品；CH?2型显微镜为日本OLYMPUS产品；800型酶标仪为美国宝特公司产品。

    1.3  哮喘模型复制［2］  造模大鼠于第1天及第7天腹腔注射100g/L OVA 1mL致敏，2周后将大鼠放入雾化箱中，用20g/L卵蛋白25mL，在最大雾化程度和最大风速的条件下雾化40min，每天1次，连续雾化2周，在雾化期间及结束后观察大鼠反应，以出现烦躁不安，呼吸频率加快，节律性点头运动为阳性反应，提示造模成功。

    1.4  药物制备  治疗药物：取胡椒、白芥子、细辛、白芷、半枫荷各等份磨至100目细粉后混合。取生姜10kg，温度50℃，压力14.4mPa，超临界CO2萃取，时间2h，得姜油约90mL，备用。另取7kg 生姜，榨汁，得生姜汁，加热煮沸10min，冷却后冰箱保存备用。取药粉加入适量姜油混合，并加蒸馏水调节至合适的软硬度，分装玻璃瓶中，经灭菌、检查、贴签,成品呈棕黄色，于低温(4℃～10℃) 状态下保存。用时以特定容器压成直径1.2cm、厚0.25cm的圆柱形小药饼，蘸姜汁用无菌敷料固定在穴位上。空白对照药物：取红米、黑米、玉米干炒处理，分别粉碎成100 目细粉后混合,拌入姜油(取生姜3kg，制备方法同上)，加蒸馏水调节至合适的软硬度,分装玻璃瓶中,经灭菌、检查、贴签，成品呈棕黄色。保存及用法同治疗药物。

    1.5  实验分组  将实验大鼠随机分为4组：正常组用生理盐水代替OVA 致敏与诱发；模型组造模雾化后腹腔注射生理盐水，同时背部给予空白对照药物敷贴；地塞米松组造模2周后开始腹腔注射1mg/kg地塞米松，同时在背部备皮予以空白对照药物敷贴；穴位贴药组造模2周后开始腹腔注射1mg/kg的生理盐水，同时在背部备皮予以治疗药物敷贴。贴药的部位位于大鼠下颈项部至上背部处(相当于人体的大椎、肺俞、脾俞、肾俞穴，取穴方法按照《实验针灸学》［3］ )，保留4h后除去，每日1 次，7 次为1 疗程，治疗结束后24h内取材。

    1.6  取材及检测方法  大鼠乙醚麻醉后取血清，采用双抗体夹心（ABC?ELISA）法测定，按试剂盒说明操作。然后打开胸腔，取双侧肺组织置于体积分数10 %的甲醛溶液中固定，石蜡包埋，3μm纵向常规病理切片，每个标本切4～5 片，常规苏木素-伊红（HE）染色，分析结果。

    1.7  统计学方法  采用SPSS11.0统计软件包进行统计分析。

    2  结果

    2.1  各组大鼠肺组织中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞浸润程度比较  模型组大鼠肺组织中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞浸润较正常组显著性增加（P＜0.01）；地塞米松组的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞浸润与模型组比较差异具有显著性意义（P＜0.05或P＜0.01）；穴位贴药组对嗜酸性粒细胞浸润有显著抑制作用（P＜0.01），但对于淋巴细胞及巨噬细胞浸润无显著作用（P＞0.05）。结果见表1、图1。

    2.2   各组大鼠外周血IL?4、IFN?γ含量变化比较  模型组大鼠血清IL?4含量较正常组显著增加（P＜0.01），而IFN?γ含量较正常组显著降低（P＜0.01）；地塞米松组及穴位贴药组大鼠血清IL?4含量较模型组显著降低（P＜0.01）；穴位贴药组大鼠血清IFN?γ含量较模型组显著升高（P＜0.01）；地塞米松组对IFN?γ含量无显著性影响（P＞0.05），结果见表2。 表1   各组大鼠肺组织中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞浸润程度比较表2   各组大鼠血清中IL?4、IFN?γ含量变化比较 统计方法：单因素方差分析；①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.01，与模型组比较

    3  讨论

    支气管哮喘属中医学"哮"及"喘"的范畴，它是一种发作性的痰鸣气喘疾患。从其病因病机方面看，哮喘的发生主要为宿痰内伏于肺，复加外感、饮食、情志、劳倦等因素，以致痰阻气道，肺气上逆所致。针对此病因病机，我们采用穴位敷贴疗法，借助药物产生的药力和热力刺激脏腑俞穴，促进体内脏腑经脉气机运行，通过气机的推动及温煦作用达到温散痰瘀之邪的目的。本实验结合临床实际，选用具有辛温散寒、化痰通络作用的胡椒、白芥子、细辛、白芷、半枫荷，再加上以生姜汁调和，加强了药物温经通络的作用，从而促进药物对穴位的刺激。在穴位选择方面，以选取背部俞穴为主，《内经》谓："诸痿呕喘，皆属于上"，哮喘病在肺，而肩背通于肺，故选用肩背部俞穴用药可使药力入肺。大椎穴是手足三阳经与督脉交会穴，调节诸阳经上传下达，完成统帅协调脏腑经络功能活动的作用。所以我们选用大椎、肺俞、脾俞、肾俞穴以达到祛痰通络，标本兼治的效果。

    报道［4－6］穴位敷贴疗法应用于本病的都取得了良好的疗效，在治疗机理上也日趋明确。研究表明，支气管哮喘是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T 淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等） 和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。目前认为EOS在哮喘患者气道的聚集是哮喘发作的一个中心环节，它是哮喘气道炎症的主要效应细胞，大多数炎性细胞最终通过EOS 产生效应［7］，而哮喘的严重程度也取决于EOS在气道的浸润与活化［8］。同时，T淋巴细胞在支气管哮喘的发病中亦有重要的作用，T淋巴细胞特别是Ⅰ型辅助T细胞因子（TH1）、Ⅱ型辅助T细胞因子（TH2）的功能失衡在哮喘气道慢性炎症中起着十分重要的作用。有研究证实［9］，IFN?γ与TH1呈正相关性，IL?4与TH2呈正相关性，他们是一对相互拮抗的细胞因子，此二者是调节TH1/ TH2 功能的关键因素。IL?4可促进IgE的合成［10－11］，下调IFN?γ的分泌，参与维持气道黏膜TH2细胞因子的表达，使TH1／TH2 平衡向TH2倾斜，从而导致气道慢性炎症。而IFN?γ在哮喘免疫调节上具有独特作用，它一方面可以减少变应原所致的EOS在气道周围炎性浸润；另一方面可以抑制TH2细胞诱导的IL?4、IL?5等细胞因子的产生，另外它还可以抑制中性粒细胞的浸润。本实验通过观察中药穴位敷贴疗法对哮喘模型大鼠外周血中IL?4、IFN?γ及肺组织中EOS的影响，旨在探讨中药穴位敷贴疗法对支气管哮喘的作用及可能的作用机制。

    本研究中模型组大鼠肺组织病理切片支气管黏膜充血水肿，支气管黏膜下见嗜酸性粒细胞浸润，肺泡间隔水肿明显，可见大量淋巴细胞浸润，肺泡内可见巨噬细胞浸润。即肺组织中以慢性炎性细胞浸润为主，提示慢性炎症的存在。通过地塞米松治疗后炎症细胞浸润明显减轻，而穴位贴药治疗可显著抑制嗜酸性粒细胞浸润，对于淋巴细胞及巨噬细胞浸润改善不是很明显。在各组大鼠外周血IL?4、IFN?γ含量的变化中我们发现：哮喘模型组大鼠外周血IL?4含量较正常组增加， IFN?γ含量较正常组降低，提示哮喘模型大鼠外周血中Th1/Th2失衡。在地塞米松组中大鼠外周血IL?4含量较模型组降低，提示地塞米松对体内炎性介质有明显的抑制作用，可直接阻止气管内慢性炎症性反应。通过穴位贴药治疗的大鼠外周血中IL?4含量显著下降，IFN?γ含量显著上升，提示穴位贴药可能通过调整大鼠体内Th1/Th2平衡来影响体内嗜酸性粒细胞生长、趋化及激活过程，从而抑制气道炎症，达到治疗哮喘的效果。本实验中穴位贴药对哮喘大鼠肺组织淋巴细胞及巨噬细胞的浸润影响不明显，可能因为穴位贴药是通过局部刺激穴位皮肤而使得体内产生相应的抗炎作用，无法完全抑制慢性炎症性反应。

    综上所述，穴位敷贴疗法通过对哮喘大鼠外周血IL?4、IFN?γ这对拮抗因子的影响，间接达到了对于Th1/Th2机制的良性调整作用，并抑制嗜酸性粒细胞及慢性炎性细胞浸润，这可能是穴位敷贴疗法治疗哮喘的机制之一。

【文献】
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