乳猪肝胶原蛋白水解物注射液的研制及对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

                  作者：邹晓军 廖汉雄 王耐勤 杨联萍，刘彤，邹清雁

【摘要】  目的与方法 摸索乳猪肝胶原蛋白水解物注射液（HCH）的制备方法,同时对其进行质量检验和初步稳定性试验；并观察其对荷瘤昆明小鼠HepA肝瘤和S180纤维肉瘤及小鼠体内肝癌H22移植瘤的影响。结果 HCH生产工艺路线合理，质量达到拟定标准要求。HCH能明显抑制HepA肝瘤生长，25、50、100、200 mg·kg-1·d-1的抑制率分别为43.26％、55.06％、74.71％、40.47％；对荷瘤小鼠S180纤维肉瘤25、50、100 mg·kg-1·d-1的抑制率分别为53.87％、76.53％、58.20％，而阿霉素（2 mg·kg-1·d-1 ）阳性对照组的抑制率为62.41％；对小鼠体内肝癌H22移植瘤生长的抑制呈剂量相关性，50、100、200 mg·kg-1·d-1的抑制率分别为48.1％、60.0％、74.8％，而卡铂（20 mg·kg-1·d-1 ）阳性对照组的抑制率为63.7％。结论 此法可制备合格的HCH，且适合于大规模生产；HCH能明显地抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。

【关键词】  胶原；肿瘤；生长抑制；小鼠

　　Abstract:Objective To investigate the methods to prepare the hepatic collagenous hydrolysates(HCH) for injection, the rudiment stability test, and the quality control study of the HCH, and to observe its effect on the tumor growth in the tumor bearing mice. Methods The dissolvability collagen were extracted from the suckling pig liver with the biochemical approach, the tumor inhibiting polypeptides for injection were prepared with the pepsin hydrolysis. The quality criteria of the product were studied. The effects of TIP on the Hep A hepatoma, H22 hepatoma and S180 fibrosarcoma were investigated.Results The product?s quality reached the quality criteria showed that the production procedure of TIP was suitable. The results showed that TIP could apparently inhibit the growth of Hep A hepatoma in the tumor-bearing mice with the inhibitory rates of 43.26％, 55.06％, 74.71％, 40.47％ at the doses of 25, 50, 100, 200 mg·kg-1·d-1 TIP; and inhibit the growth of S180 fibrosarcoma with the inhibitory rates of 53.87％, 76.53％, 58.20％ at the respective doses of 50, 100, and 200 mg·kg-1·d-1 TIP, the relative inhibitory rate of the positive adriamycin（2 mg·kg-1·d-1）control was 62.41%; TIP could apparently inhibit the growth of H22 hepatoma transplanted in the mice at a dose-dependant way with the inhibitory rates of 48.1％, 60.0％, 74.8％ at the respective doses of 50, 100, and 200 mg·kg-1·d-1 HCH, and the relative inhibitory rate of the positive adriamycin（20 mg·kg-1·d-1） control was 63.7%.Conclusion HCH prepared with the biochemical approach was qualified and suitable for large?scale prodiction. HCH could apparently inhibit the growth of tumor transplanted in the mice.

　　Key words:collagen; tumor; growth inhibition; mice

　　O’Reilly等［1］从小鼠血管内皮瘤（EOMA）的培养上清中发现了一种能特异性地抑制毛细血管内皮细胞生长的因子，其分子量为20 kD，命名为内皮抑素（endostatin, ES）。ES是胶原ⅩⅧ的N端产物。胶原ⅩⅧ为血管内皮基底膜的组成成份，主要分布于肝、肺、肾等组织，其中肝实质细胞、胆管上皮细胞和新生血管内皮细胞能合成和分泌胶原ⅩⅧ。根据以上研究结论，我们设计了从肝组织中提取可溶性胶原，经水解后制备肿瘤生长抑制物的研究思路［2］。现将实验结果如下。

　　1材料和方法

　　1．1HCH的制备
    　　
　　取新鲜的乳猪肝去掉血管及筋膜,用注射用水清洗后匀浆，水浴加热至80 ℃离心；沉渣加10％稀盐酸调pH值为4～5，再加胃蛋白酶后于4 ℃保存20 h；用0.1 mol·L-1氢氧化钠调pH值到7.0，离心，取上清液；再用10 kD的超滤膜超滤，混合，除菌，分装，检验合格后，即制成HCH。

　　1．2分子量范围测定
      
　　采用SDS-PAGED电泳法，具体方法与步骤参见［3］

　　1．3初步稳定性试验
    　　
　　对3批产品的初步稳定性试验主要从温度、光照、加速试验等3个方面进行考察。进行4 ℃留样观察、常温试验、高温试验；考察项目有：外观、澄清度、蛋白定性、pH值、多肽含量、活性、热原试验、安全试验、无菌试验等，其检测按拟定的质量标准进行。

　　1．4HCH中RNA含量测定采用定糖法测定［4］。

　　1．5HCH对荷瘤昆明小鼠HepA肝瘤和S180纤维肉瘤的抑瘤活性测定

　　1．5．1HepA小鼠肝瘤细胞株（腹水型）和S180小鼠肝瘤细胞株（腹水型），引自中山大学实验动物中心。昆明小鼠：雄性，动物生产许可证编号：SCXK（粤）2003-0001，购自广州中医药大学实验动物中心。

　　1．5．2肿瘤细胞小鼠腹腔接种用含10％小牛血清的DME/F12培养液培养，收集细胞，用无菌Hanks液将细胞稀释成1×109～2×109个/L，进行昆明小鼠（体质量26～30 g）腹腔接种，每鼠0.3 mL，7～10 d后进行试验。

　　1．5．3制成小鼠荷瘤模型将有腹腔接种肿瘤细胞7～10 d的小鼠断颈处死，抽取腹水制备1×109～2×109个/L浓度的细胞悬液，活细胞数应大于85％。取该悬液0.1 mL种植于每只小鼠（体质量18～24 g）腰部正中线皮下。随机分组。

　　1．5．4种植后第7天开始给药。荷HepA肝瘤小鼠，阴性对照组每只小鼠腹腔注射生理盐水0.5 mL·d-1，阳性对照组腹腔注射阿霉素2 mg·kg-1·d-1，组分4个剂量组分别腹腔注射HCH 25、50、100、200 mg·kg-1·d-1。末次给药后次日，拉颈处死动物，称体质量，刨出实体瘤，称瘤重，抑瘤率。

　　1．6HCH对ICR种小鼠体内肝癌H22移植瘤的抑瘤活性测定

　　1．6．1ICR种小鼠，18～22 g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物生产许可证编号：2002（京）?0003.SCXK。饲养于北京大学人民SPF级动物实验室内，许可证号：SYXK11?00?0001。小鼠每笼10只，自由进食饮水。小鼠肝癌H22为昆明种小鼠传代保种的腹水型瘤株，实验时抽取第7天的癌性腹水，经生理盐水按1∶3稀释成瘤细胞悬液。

　　1．6．2取ICR小鼠50只，于右腋部皮下接种H22细胞悬液，每只0.2 mL。接种后将小鼠随机均分为5组，每组10只。次日，开始给药，实验组共3组，剂量分别为：50、100、200 mg·kg-1·d-1，腹腔注射给药，容量为0.1 mL·10 g-1体质量，阳性对照组给予卡铂，20 mg·kg-1;阴性对照给予等容量生理盐水。每日给药1次，连续7 d。末次给药后次日，拉颈处死动物，称体质量，刨出实体瘤，称瘤重，计算抑瘤率。
广东药学院学报，2007，23(2)第2期邹晓军,等.乳猪肝胶原蛋白水解物注射液的研制及对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

       2结果

　　2．13批注射液质量检验结果  
   
　　结果显示连续3批产品质量符合内控质量标准，见表1，表明该生产工艺稳定、质量可控。

　　表13批注射液质量检验结果　略

　　2．2分子量范围测定结果
    　　
　　电泳结果显示的分子量范围为3.494～8.702 kD。用20%磺基水杨酸钠作蛋白定性试验显阴性，表明HCH属小分子多肽。

　　2．3初步稳定性试验结果

　　2.3.14℃留样观察试验分别放置0、3、6、9、12个月取样检测，结果表明，HCH中各项质量指标基本稳定。

　　2.3.2光照试验光强度为3 200 LX，分别于第5天和第10天取样检测，结果表明上述考察指标无明显改变，说明HCH对光稳定。

　　2.3.3加速试验 在40 ℃、37 ℃、30 ℃、25 ℃、20 ℃进行3个月考察，分别于第12、24、48、72、90天取样，外观观察温度越高、时间越长，颜色就越深，活性有逐渐下降的趋势；考察多肽含量符合一级反应。

　　2．4HCH对荷瘤小鼠HepA肝瘤生长的影响
    　　
　　接种HepA肝瘤细胞后共观察36 d，在观察到24 d时，除阿霉素组有1只小鼠死亡外，其他各组均无死亡；24～36 d时对照组有3只小鼠因瘤体过重消耗或瘫痪而死亡，HCH组200 mg/kg剂量组有1只小鼠因瘫痪而死亡。中途死亡的小鼠称体质量及瘤重，所得数据纳入整体数据进行统计学处理，结果见表2。阿霉素组在过程中第21天即出现小鼠死亡，当即停用阿霉素，至第35天共死亡6只，死亡率为75％（同对照组比，P＜0.05），体质量及瘤重的数据没有详细统计，因而未列入表中。

　　2．5HCH对荷瘤小鼠S180纤维肉瘤生长的影响
    　　
　　接种S180纤维肉瘤细胞后观察至24天，阿霉素组出现2只小鼠死亡，即结束实验，称体质量及瘤重进行统计学处理，结果见表3。结果显示，HCH组中50 mg/kg比阿霉素组抑瘤率高14%。

　　2．6HCH对ICR种小鼠体内肝癌H22移植瘤生长的影响
    
　　结果见表4。结果显示HCH组中200 mg/kg比卡铂组抑瘤率高11%。
　　
　　表2HCH对荷瘤小鼠HepA肝瘤的影响　略

　　表3HCH对荷瘤小鼠S180纤维肉瘤生长的影响　略

　　表4 HCH对ICR种小鼠体内肝癌H22移植瘤生长的影响　略

　　3讨 论
      
　　ES是美国Entremed公司的专利产品，位于小鼠胶原ⅩⅧC末端非胶原（NC11）区，其作用机制与细胞黏附分子有关［1］。最近发现人类胶原ⅩⅤ非胶原（NC10）区同样具有抑制血管增生的活性，以及ES裂解的3～4 kD小分子量的多肽片段同样具有抑制肿瘤血管生长的活性［5］。我们从乳猪肝可溶性胶原中制备的小分子肽，也显示了一定抗荷瘤小鼠肿瘤生长的作用，其机制可能与ES的作用机制有关。基因工程法生产的蛋白，其产量少，成本高，难以满足临床需要，用量少则难以达到有效剂量。利用生化提取水解法制备具有抑制肿瘤生长的活性物质（分子量为2～4 kD），对不同来源的小鼠肿瘤细胞在活体内均有抑制作用，具有产量大、成本低、质量可控、安全性试验和稳定性试验均符合生化药物的质量标准要求，可满足大量临床用药的需求。
    　　
　　本方法制备的乳猪肝胶原蛋白水解物，在小鼠体内除对H22肝瘤细胞显示明显的抑瘤剂量效应外，对其他两株细胞有明显的抑制作用，但剂量抑制作用不明显。这与我们先前的报道相一致［6］，对裸小鼠肾包膜移植的人源性胰腺癌细胞，高剂量的乳猪肝胶原蛋白水解物注射液对肿瘤细胞的抑制作用不如中剂量组，其机理目前尚不清楚，可能与新生血管内皮上的内皮抑素受体量有关，高剂量时内皮抑素的受体已饱和，而乳猪肝胶原蛋白水解物注射液中的其他分子如生长因子对肿瘤细胞可能有一定的促进作用，因而影响其抑瘤效果。

【】
  　　［1］O’ REILLY M S,BOEHM T, SHING Y,et al.Endostatin:an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth［J］.Cell,1997,88:277～285.

　　［2］张海松，邹晓军，叶英传，等.促肝细胞生长素提取工艺的改进［J］.生化药物杂志,2002,23(4):194

　　［3］杨联萍，孔祥平，易学瑞.SDS-PAGE电泳对小分子多肽的分析［J］.生物工程进展,1198,18(6):49～51.

　　［4］ 国家药典委员会.国家药品标准:第十六册［S］.北京：化学出版社，2003:95-96.

　　［5］李希，徐根兴，王建军.重组人融合蛋白片段的构建及体外抑制内皮细胞增殖活性［J］.中国肿瘤生物治疗杂志,1999,6(3):240～241.

　　［6］曾平鲁，黄文革，邹晓军，等.乳猪肝胶原水解物和促肝细胞生长素对裸小鼠肾包膜移植的人源性胰腺癌细胞的影响［J］.中国病理生理杂志,2004(4):504～505