红树林内生真菌抗细菌和抗真菌活性的初步研究

【摘要】  目的 分离和筛选具有抗细菌和抗真菌活性的红树林内生真菌。方法 从红树林植物桐花树、海漆、秋茄、木榄、白骨壤、银叶树中分离到60株内生真菌，对其代谢产物进行抗菌检测，通过滤纸片法来检测内生真菌代谢产物抗细菌和抗真菌活性。结果 共有35株内生真菌具有抗细菌活性，占待侧菌株总数的58.3％，其中以不产孢类、青霉属、曲霉属、镰孢属为主，分别占活性菌株总数的51.4％、8.6％、8.6％、8.6％；共有49株内生真菌具有抗真菌活性，占待侧菌株总数的81.7％，其中以不产孢类和盘长孢属为主，分别占活性菌株总数的44.9％、17.1％。 结论 红树林内生真菌是抗菌活性物质的一个潜在的、丰富的资源库，值得进一步研究和开发。

【关键词】  红树林；内生真菌；代谢产物；生物活性

　　Abstract:Objective   To isolate and screen fungal endophytes with antibacterial and antifungal activities from mangrove plants.Methods  The antibacterial and antifungal activities test of fungal endophytes from mangrove plants were used by paper disc method.Results  Sixty strains of endophytic fungi were isolated from Aegiceras corniculatum, Excoecaria agallocha, Kandelia candel, Bruguiera gymnorrhiza, Avicennia mariana, Heritiera littoralis.The result of the antibacterial and antifungal assay shows that thirty five strains of the endofungi (58.3% of total tested strains ) have antibacterial activities, the active strains mostly belong to sterile groups (51.4 % of active strains), Penicillium(8.6%), Aspergillus(8.6%), Fusarium(8.6%); forty nine strains (81.7% of total tested strains) have antifungal activites, most of them belong to sterile groups (44.9 % of active strains), and Gloeosporium (17.1%).Conclusion  Mangrove fungal endophytes were potential and rich resources of antimicrobial compounds, which need to explore further.

　　Keywords: mangrove plants, fungal endophytes, metabolites，bioactivity

　　内生真菌(endophyte)指生活于健康植物组织内部、不引发植物产生明显病症的一类真菌。但在植物衰老或外界刺激条件下，植物自身免疫力下降，也可能出现某些病症。它们全部或部分生活周期生活在植物组织内。这类真菌生活在植物体这一特殊生境中，不但能促进植物的生长发育［1］，提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力［2］，还能产生多种具有生物活性的次生代谢产物，在医药业、农业的生物防治方面都显示出重要的应用价值［3］。
    
　　1993 年, Strobel 等［4］等从短叶红豆杉(Taxus brevifolia) 的韧皮部中分离到一株能产紫杉醇（Taxol) 的内生真菌（Taxomyces andreanae)，受此启发,国内外学者也相继在其他陆生植物开展此方面的研究，并从中分离具有多种具有抗肿瘤活性、抗真菌活性、免疫抑制活性的内生真菌［5,6］。红树林作为生长在热带和亚热带海湾河口潮间带的一种特殊的生态系统，一直处于高盐、频繁的潮汐、强风、高温、强紫外辐射和缺氧污泥的海陆潮间带环境［7］，其生境非常特殊，研究发现它们自身许多成分也具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等药用价值［8］。它们的内生真菌同时又具有海洋微生物的特点，这也使得红树林内生真菌具有独特的代谢途径和遗传背景，其种类和产物化学类型多样性也比较丰富，因此有可能从中发现一些新的真菌种类和新的代谢产物。本研究对深圳福田红树林保护区的6种红树林的内生真菌进行了较为系统的分离，并从中筛选具有抗菌活性的菌株，为开发新的抗菌药物提供基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  植物样品来源
    
　　在深圳福田红树林保护区采集桐花树（Aegiceras corniculatum）、 海漆（Excoecaria agallocha）、秋茄（Kandelia candel）、木榄（Bruguiera gymnorrhiza）、白骨壤（Avicennia mariana）、银叶树（Heritiera littoralis）的叶、茎、根、树皮、气生根等样品，采集后放于冰盒中保存, 4 h内处理样品，进行内生真菌的分离。

　　1.2  培养基

　　1.2.1  PDA培养基
    
　　马铃薯200 g ,葡萄糖20 g ,琼脂15 g ,50％人工海水1 000 mL。

　　1.2.2  真菌发酵培养基
    
　　2％葡萄糖， 1％蛋白胨，0.5％酵母膏，50％的人工海水，pH 6.5。

　　1.2.3  LB培养基
    
　　称取10 g 蛋白胨 、5 g 酵母膏、10 g NaCl，加蒸馏水溶解后，调pH至7.4，定容至1 000 mL。

　　1.2.4  促孢培养基
    
　　KH2PO4 1 g , KNO3 1 g ,MgSO4·7H2O 0.5 g ,KCl 0.5 g ,淀粉 0.2 g ,葡萄糖 0.2 g ,蔗糖 0.2 g ,琼脂 15 g ,水1 000 mL。

　　1.3  拮抗试验菌株

　　1.3.1  试验细菌
    
　　金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus  NICPBP 26112)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus  MIG1.22)、大肠杆菌 (Escherichia coli  ATCC 8739)、青枯菌（Ralstonia dolaanacearum）分离于番茄植株。

　　1.3.2  试验真菌
    
　　假丝酵母菌(Candida albicans  ATCC 10231)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae  MIG2.34)均购自广东省微生物研究所。新月弯孢霉(Curvularia lunata) 由本实验室保存；茄丝核菌（Rhizoctonia solani K）分离于患病番茄植株；叶枝霉 (Cladosporium herbarum)分离于患病番茄植株；尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) 分离于香蕉植株。

　　1.4  植物内生真菌的分离
    
　　叶、叶脉、茎、树皮（韧皮部）等样品用自来水冲洗掉泥土，然后进行严格的表面消毒程序：依次浸泡在75％酒精1min，3%～5%有效氯的次氯酸钠溶液3 min，75%的酒精0.5 min， 然后再用无菌水冲洗3遍。晾干后，在超静台将其剪成约0.5 cm×0.5 cm 左右小片。将处理好后剪成的小片铺于PDA平板上，加入氯霉素与链霉素各50 μg/mL抑制细菌的生长，在26 ℃培养培养2～3 周分离内生真菌。这些平板在第1周要每天检查1次，然后可以3、4 d检查1次。一旦发现有菌丝从组织小块长出，应马上将其转接到另一新的平板上，经几次纯化保存于PDA斜面。

　　1.5  表面消毒效果检查
    
　　［9］ 方法观察表面消毒效果。

　　1.6  内生真菌的鉴定
    
　　使用PDA 培养基, 采用载玻片法培养内生真菌, 根据《真菌鉴定手册》［10］中描述的真菌形态特征进行鉴定。不产孢子的菌株，需使用催孢培养基或紫外线照射来诱导孢子的产生。仍不产孢者归不产孢类。

　　1.7  内生真菌发酵及代谢物提取
    
　　分离到的红树林内生真菌斜面培养物经活化后分别接种至20 mL真菌发酵培养基，26 ℃摇床上以190 r/min的转速培养7～10 d，发酵结束后将发酵物冷冻干燥，再用10 mL甲醇浸泡抽提1 d。取甲醇提取液清液，挥发干后，用2 mL甲醇溶解配成10倍浓缩液。

　　1.8  内生真菌代谢物抗细菌、抗真菌活性检测
    
　　采用滤纸片法进行抗菌活性检测: 活化后的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌与青枯菌培养液用无菌水稀释至10-4，取0.1 mL菌悬液（约105 cfu/mL）涂布于LB平板上。用滤纸片（直径5 mm）吸取内生真菌代谢产物粗提物溶液，放置于平板上，37 ℃培养1～2 d，观察抑菌圈的大小及有无。白色念球菌除取10-3稀释液200 μL涂布PDA平板外，其余均与细菌相同，并用空白滤纸片吸取甲醇溶液作为空白对照；将丝状病原真菌接种于PDA培养基平板中央，在病原菌周围放置用粗提物浸过的滤纸片，培养3～5 d后观察病原菌菌落生长情况，并用空白滤纸片吸取甲醇溶液作为空白对照。

　　2  结果

　　2.1  红树林内生真菌的分离
    
　　本研究从深圳福田红树林保护区的6种红树林多个部位共分离到60株内生真菌作为抗细菌活性和抗真菌活性的待筛菌株，并对它们进行了分类鉴定，结果见表1。从表1可以看出，分离到60株红树林内生真菌包括11个属和不产孢类，其中以不产孢类、盘长孢属、镰孢属、曲霉属为主要类群，分别占45.0％、11.7％、8.3％、8.3％。

　　表1  60株待筛菌株种类及来源（略）

　　Tab.1  The taxa and origin of 60 endophytic fungi which are screened

　　2.2  红树林内生真菌的抗细菌活性
    
　　从表2可以看出，在60株待筛红树林内生真菌中，有35株内生真菌的代谢产物对一种或多种指示细菌有抑制活性，占待筛菌株的58.3％，这说明红树林内生真菌存在着丰富的抗细菌资源。

　　2.3  红树林内生真菌的抗真菌活性
    
　　红树林内生真菌对细菌的拮抗实验结果见表2。从表2可以发现，60株待筛红树林内生真菌甲醇代谢产物有49株（占81.7%）的代谢产物具有抗真菌活性；其中有42株内生真菌的代谢产物对丝状真菌具有抗性，占待侧菌总数的70.0％；有22株红树林内生真菌的代谢产物对人类皮肤深部感染病菌－假丝酵母菌有抗性，占待侧菌总数的36.7％。实验结果表明，红树林内生真菌蕴藏着丰富的抗真菌活性物质产生菌，是开发抗真菌药物的潜在资源。

　　2.4  内生真菌抗菌活性菌株属的分布
    
　　从表3可以看出：红树林内生真菌中具抗细菌活性的菌株分布在9个属中，其中以不产孢类、青霉属、曲霉属、镰孢属为主，各占活性菌株总数的51.4％、8.6％、8.6％、8.6％；红树林内生真菌具抗真菌活性的菌株分布在12个属中，以不产孢类（44.9％）和盘长孢属（17.1％）为主。以上结果表明，内生真菌抗菌活性菌株的种属分布具有多样性。

　　3  讨论
    
　　过去筛选产生抗菌物质微生物的重点一直是土壤微生物，特别是链霉菌。但自20世纪60年代以来，从链霉菌中被重复发现的抗生素高达95%，筛选得到的有价值的抗生素比率逐年下降。于是人们将筛选抗菌物质的注意力逐渐集中于其他生态系统的生物，尤其是那些特殊生境的微生物如海洋微生物、植物内生菌等。近年来的研究表明,海洋微生物是新物质的巨大宝库，人们在海洋中找到了大量结构新颖，且活性很强的生物活性物质，如抗菌、抗病毒、抗肿瘤等物质［11］；植物内生菌作为一种特殊生境的微生物也同样具有丰富的生物功能多样性，在生物控制、无公害农业和医药开发方面有着很好的开发前景。红树林作为生长在热带和亚热带海湾河口潮间带的特殊生态系统，其生境非常特殊，其体内的内生真菌既是植物内生菌，又具有海洋微生物的特点，这也造就了红树林内生真菌具有独特的代谢途径和遗传背景，因此对它们的代谢产物进行研究可能会有可喜的发现。本研究结果表明，红树林内生真菌具有广泛的抗菌活性：抗细菌活性菌株占58.3％；抗真菌活性菌株占81.7％，其中70%菌株的代谢产物对丝状真菌具有抗性，36.7％对人类皮肤深部感染病菌－假丝酵母菌有抗性。内生真菌的属种分布和拮抗作用具有多样性：分离到60株红树林内生真菌除不产孢类外，分布于11个属，其中不产孢类、盘长孢属、镰孢属、曲霉属为主要类群；红树林内生真菌中不产孢类抗微生物活性所占比例明显较高，不同属种的菌株对同一指示菌的抗菌作用有较大差别,对金黄色葡萄球菌和茄丝核菌有拮抗作用的菌株种类较多，同属的内生真菌对的病原菌拮抗作用及抗菌效果也各不相同。植物内生真菌及其抗微生物活性的多样性 为人们开发抗菌药物提供了重要的资源保证。
    
　　在对红树林内生真菌的抗真菌活性研究发现，其抗真菌活性菌株比例比从水稻、香蕉等分离到的内生真菌和其他陆生植物内生真菌（特别是抗丝状真菌）都要高［12-14］。这说明红树林内生真菌可能比其他环境中的真菌蕴含着更为丰富的抗真菌活性的资源。由于真菌感染是人类面临的一个越来越严重的一个健康问题，特别是对于艾滋病人和其他免疫力低下的患者，开发出新的抗真菌感染的药物显得尤为重要。植物真菌致病菌如茄丝核菌、尖孢镰刀菌、新月弯孢霉等都能引起多种植物的病害，而且目前没有有效又环保方法防治，而植物内生真菌作为生物农药的生物防治方法为此提供了一个新途径。本研究结果表明，许多红树林内生真菌产生的代谢产物不仅对植物丝状病原真菌表现出有着抗性而且对人类致病真菌也存在抗性，它们为开发新的抗真菌感染的药物以及植物真菌病的生物防治提供了重要的资源库，表现出良好的应用前景，值得进一步深入的研究。

　　表2  红树林内生真菌代谢物的抗细菌活性和抗真菌活性（略）

　　Tab.2  Antibacterial and anti?fungi activities of endophytic fungi from mangrove plants

　　根据抑菌圈直径比较活性,0：无抑制活性；+：≤10 mm；++：10～20 mm；+++：≥20 mm

　　表3  红树林内生真菌抗菌活性菌株属的分布（略）

　　Tab.3  Proportion of taxa of mangrove endophytic fungi of antimicrobial activities
　　

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