健骨二仙提取液对去卵巢大鼠胫骨中段皮质骨形态计量学的影响
【摘要】 目的 探讨健骨二仙提取液对去卵巢大鼠皮质骨形态计量学的影响，进一步研究该药防治骨质疏松症的作用机理。方法 将４２只６．５月龄雌性近交系大鼠随机分为４组：假手术组、单纯去卵巢组（即模型组）、卵巢切除＋健骨二仙提取液（即组）、卵巢切除＋倍美力组（即倍美力组），采用去卵巢方法进行骨质疏松造模，６周后药物干预治疗１０周，采用皮下注射盐酸四环素和钙黄绿素进行骨表面的双荧光标记，全部处死大鼠取右胫骨中段不脱钙骨切片进行骨形态计量学参数测定。结果 与去卵巢组相比较，治疗组骨髓腔总面积减小（Ｐ＜０．０５），外膜面的骨形成各项参数均无明显变化，治疗组和倍美力组骨内膜面的骨吸收参数均降低（Ｐ＜０．０１），治疗组内膜面骨形成参数降低（Ｐ＜０．０５或＜０．０１），使皮质骨转换水平比倍美力组更接近假手术组水平。结论 健骨二仙提取液可抑制去卵巢后高转换型骨质疏松的形成，总体抑制骨吸收大于骨形成，减少了骨量丢失和骨结构退化，是该药防治骨质疏松症的机理之一。
【关键词】 健骨二仙提取液；原发性骨质疏松症；骨形态计量学；实验研究；动物；大鼠；龟板胶；鹿角胶；人参
〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｊｉａｎｇｕ Ｅｒｘｉａｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｍｉｄｄｌｅ ｔｉｂｉａ ｃｏｒｔｅｘ ｉｎ ＯＶＸ ｒａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ． Ｍｅｔｈｏｄ Ｔｈｅ ４２ ｆｅｍａｌｅ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ （ＷＡ／Ｊｉｃ，ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅ，ＳＰＦ ｇｒａｄｅ） ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ４ ｇｒｏｕｐｓ：Ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ （ｎ＝１１） ｆｅｄ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ，ＯＶＸ ｇｒｏｕｐ （ｎ＝１０） ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ，ＯＶＸ＋ｈｅｒｂ ｇｒｏｕｐ（ｎ＝１１） ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＋Ｐｒｅｍａｒｉｎ ｇｒｏｕｐ（ｎ＝１０） ｗｉｔｈ ｐｒｅｍａｒｉｎ． Ｔｈｅ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ ｍｏｄｅｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｅｄ ｅｘｃｅｐｔ ｆｏｒ ｇｒｏｕｐ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅａｔｅｄ １０ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ６ ｗｅｅｋｓ ｏｆ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ－ＨＣｌ ａｎｄ Ｃａｌｃｅｉｎ ｈｙｐｏｄｅｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｍｉｄｄｌｅ ｔｉｂｉａｓ ｗｅｒｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｂｙ ｕｎｄｅｃａｌｃｉｆｉｅｄ ｓｅｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅｎ，ａｌｌ ｔｈｅ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｋｉｌｌｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｉｇｈｔ ｕｎｄｅｃａｌｃｉｆｙｉｎｇ ｔｉｂｉａ ｓｅｃｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｂｏｎｅ ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ． Ｒｅｓｕｌｔ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＯＶＸ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ａｒｅａ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｒｒｏｗ ｃａｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ （Ｐ＜０．０５），ａｌｌ ｔｈｅ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｓ ｏｎ ｅｘｔｅｒｉｏｒ ｐｅｒｉｏｓｔｅａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｃｈａｎｇｅｓ，ｔｈｅ ｂｏｎｅ ａｂｓｏｒｂｉｎｇ ｐａｒａｍｅｔｅｓ ｏｎ ｉｎｔｅｒｉｏｒ ｐｅｒｉｏｓｔｅａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｄ ｐｒｅｍａｒｉｎ ｇｒｏｕｐｓ ｌｏｗｅｒｅｄ（Ｐ＜０．０１） ａｎｄ ｔｈｅ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｓ ｏｎ ｉｎｔｅｒｉｏｒ ｐｅｒｉｏｓｔｅａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｒｏｕｐ ｌｏｗｅｒｅｄ（Ｐ＜０．０５ ｏｒ Ｐ＜０．０１）． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｅｍａｒｉｎ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｉｂｉａ ｃｏｒｔｅｘ ｗａｓ ｃｌｏｓｅｄ ｔｏ ｔｈａｔ ｉｎ ｓｈａｍ ｇｒｏｕｐ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｔｙｐｅ ｏｆ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｌｏｓｉｎｇ ｓｐｅｅｄ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｓｓ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｂｏｎｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．
〔Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ〕 ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ；Ｊｉａｎｇｕ Ｅｒｘｉａｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｂｏｎｅ ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ；ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ；ｒａｔｓ
原发性骨质疏松症是一种常见的老年性骨代谢疾病，我们采用益气补肾法治疗该病取得较为满意的临床疗效，并对该药的作用机理进行了研究及报道［１］１－８［２］１０－１３。为进一步考察其对骨形态学的影响，以健骨二仙提取液对去卵巢大鼠进行了胫骨中段皮质骨骨形态计量学研究，现将实验方法及结果报道如下。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 动物 ６．５月龄雌性ＷＡ／Ｊｉｃ Ｗｉｓｔａｒ ＳＰＦ级近交系大鼠（院上海实验动物中心提供，动物合格证号：中科动管第００３号）４２只，体质量（２００±１０）ｇ。饲养于广州中医药大学实验动物中心二级动物实验室（环境设施合格证号：２０００－Ｂ００８）。
１．１．２ 药物 健骨二仙提取液（由龟板胶、鹿角胶、枸杞，人参等药物按传统制剂工艺提取而成，制成浸膏，含生药２ ｇ／ｍL，由广州中医药大学制剂室提供）；倍美力０．６５ ｍｇ／片（美国药典标准，由美国惠氏－艾尔斯特制药公司生产，批号：５５０９００３）。
１．１．３ 试剂 盐酸四环素（华美公司分装，ＢＦ１００４）；荧光染料钙黄绿素（Ｃａｌｃｅｉｎ，上海三爱思试剂有限公司，Ｑ／ＧＨＳＣ ０９９５－１９９８）；二丁基邻苯二甲酸盐（Ｄｉｂｕｔｙｌ ｐｈｔｈａｌａｔｅ，美国西格玛公司生产Ｌｏｔ：１０６Ｈ１４５２）；骨染料（Ｍａｓｓｏｎ－Ｇｏｌｄｎｅｒ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ；Ｐｏｎｃｅａｎ Ｆｕｃｈｓｉｎ Ｓｔｏｃｋ；Ｐｈｏｓｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ ａｃｉｄ－Ｏｒａｎｇｅ Ｇ；Ｌｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎ，美国西格玛公司生产）。
１．１．４ 仪器 低速锯（美国Ｂｕｅｈｌｅｒ公司）；半自动图像数字化分析仪（包括光镜和荧光显微镜，日本Ｎｉｋｏｎ公司）；数字化板、电脑和形态学程序“Ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｙ”体视学软件（美国）。
１．２ 方法
１．２．１ 分组与造模 ４２只大鼠随机分成４组：假手术组１１只；单纯卵巢切除手术组（简称模型组）１０只；卵巢切除＋健骨二仙提取液治疗组（简称治疗组）１１只；卵巢切除＋倍美力治疗组（简称倍美力组）１０只。用２％戊巴比妥钠，按５０ ｍｇ／ｋｇ腹腔麻醉后，备皮无菌条件下从腰椎正中线做２ ｃｍ左右皮肤切口，钝性分离腰椎双侧肌层进入腹腔背侧，完整切除双侧卵巢后，止血，逐层缝合后，切除卵巢的（即模型组）。以相同方法进入腹腔背侧后，切除少许脂肪组织，止血缝合后，为假手术组。造模后饲养时间为６周。
１．２．２ 给药方法 假手术组及去卵巢组：以生理盐水每只０．９ ｍＬ每天灌胃１次。治疗组：按［３］，含生药６．２５ ｇ／ｋｇ以健骨二仙提取液每天灌胃１次；倍美力组：按文献［３］计算，以倍美力６５．１ μｇ／ｋｇ每天灌胃１次。给药干预治疗１０周。处死前第１３、１４天，皮下注射盐酸四环素２５ ｍｇ／（ｋｇ·ｄ），处死前第３、４天，皮下注射钙黄绿素５ ｍｇ／（ｋｇ·ｄ），进行骨组织的双荧光标记。实验１６周时采用２％戊巴比妥钠麻醉，右心室抽血处死，迅速取右胫骨，用低速锯将其锯为３段，取胫骨中段，先以横断面做较厚的锯片，然后打磨成１０ μｍ左右厚片；骨形态计量学检测用半自动图像数字化仪，测量横断面骨组织的各参数，并据此得出各计算参数。
１．３ 统计学分析
所有数据采用ＳＰＳＳ１０．０软件包进行方差分析，以均数±标准差表示。
２ 结果
２．１ 对胫骨中段皮质骨形态计量学静态参数的影响
各组胫骨中段皮质骨静态参数测定切片如图１，参数结果详见表１。骨组织总面积，即整个横断面面积，代表骨外膜骨形成的情况，骨组织总面积增大表示骨形成增加，反之表示骨形成减少；骨髓腔总面积，反映骨内膜面骨吸收与骨形成的情况，“增大”表示骨吸收增加或骨形成减少，“不变化”表示两者平衡，“缩小”表示骨吸收减少或骨形成增加；皮质骨面积，能综合反映内外骨面变化的结果，还应减去皮质内小孔的面积；皮质骨百分率，为皮质骨占总面积的百分比，是相对值，意义与骨组织总面积基本一致。
对于骨组织总面积和骨髓腔总面积，模型组较假手术组均有增加，其差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。另外，实验观察到，组与模型组相比较，骨髓腔总面积减少，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。其他指标以及其他组间的比较，均无统计学差异。
２．２ 对胫骨中段皮质骨外膜面骨形态计量学动态参数的影响
各组胫骨中段皮质骨外膜面骨形态计量学动态参数测定切片见图２，参数结果见表２。
对于外膜面骨形成参数标记周长百分率、骨矿化沉积率和骨形成率。模型组较假手术组均有增加（Ｐ＜０．０５或０．０１），治疗组与倍美力组两组虽较模型组有下降趋势，但未见统计学差异，倍美力组外膜面的３个骨形成参数高于假手术组（Ｐ＜０．０５），而治疗组未见此种改变。
２．３ 对大鼠胫骨中段皮质骨内膜面骨形态计量学动态参数的影响
各组胫骨中段皮质骨内膜面骨形态计量学动态参数测定切片见图３，参数结果见表３。
内膜面骨形成参数主要有标记周长百分率、骨矿化沉积率和骨形成率。模型组和倍美力组各项骨形成指标较假手术组增高（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５），治疗组仅骨矿化沉积率较假手术组升高（Ｐ＜０．０１）；与模型组相比较，治疗组骨形成的三项参数均有不同程度降低（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５），其余各组间对照无统计学差异。对于内膜面骨吸收周长百分率，倍美力组、模型组都较假手术组升高（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５），治疗组暂未出现具有统计学差异的增高；与模型组相比较，假手术组、治疗组和倍美力组的骨吸收周长百分率都处于较低水平（Ｐ＜０．０１）。
３ 讨论
骨组织形态计量学是近年起来的一门体视学技术，能定量观察和研究骨组织形态及结构，从组织学上，对骨的微细结构、骨质的特征等方面进行研究。未脱钙标本的骨组织形态学分析，可以把药物对松质骨和皮质骨的影响，在组织水平和细胞水平上做出评价，经四环素和钙黄绿素等荧光物质双标记，还可以对骨矿代谢和骨形成过程进行定量分析。
分析本研究的大鼠胫骨中段皮质骨静态学参数结果，模型组织总面积及骨髓腔总面积均增大，最终表现为皮质骨百分率降低，显示去卵巢后雌激素下降导致的高转换型骨量丢失，虽然不如松质骨骨量丢失快速和显著，亦提示造模在皮质骨可以获得成功。由于皮质骨结构致密，与松质骨相比较，血管和软组织少，雌激素受体在皮质骨中的表达水平远较松质骨低［４］２０５４－２０５５，因此，对去卵巢和药物干预诱导的骨质变化在短期内不明显［５，６］。此次实验仅发现健骨二仙提取液对控制骨髓腔的扩大有一定的治疗意义。如果期望在皮质骨得到更好的造模效果或取得更好的药物疗效，需要更长的造模时间和药物治疗干预时间。
通过分析动态学参数结果，往往可以获得静态学参数结果形成的原因，且通过药物干预，皮质骨动态参数短期内仍可能出现某些变化，可以用于观察骨组织对药物的反应性［７］。综观此次实验也表现为动态参数的变化比静态参数变化明显。动态学参数中，去卵巢组外、内膜面的标记周长百分率、骨矿化沉积率、骨形成率等骨形成指标均升高，内膜面骨吸收周长百分率也升高，提示为高转换型皮质骨骨量丢失，这与静态学参数结果的表现一致，均印证了造模成功。去卵巢后采用健骨二仙提取液进行治疗干预，实验结果提示：健骨二仙提取液对外膜面的骨形成各项参数均未产生明显影响，对内膜面的骨形成、骨吸收参数则均有明显的控制，提示对内膜降低骨转换速率有较好的控制，对外膜面的高转换则无明显效果，因此能控制骨髓腔快速扩大，而防止皮质骨的骨量流失。去卵巢后采用倍美力治疗干预，实验结果提示：倍美力对大鼠胫骨中段皮质骨外、内膜面的骨形成各项参数均未明显控制，对内膜面的骨吸收参数控制则有效，表现与对松质骨的影响［１］２，５不同。相比较，健骨二仙提取液治疗组的骨转换水平比倍美力更接近假手术组水平，考虑与雌激素受体在皮质骨中的表达水平远较松质骨低［４］２０４８，２０５７有关，而健骨二仙提取液的作用机理则不单纯依赖雌激素受体［１］２－４，因此在该实验周期表现出对皮质骨代谢的影响较倍美力强。
健骨二仙提取液通过抑制骨高转换，总体抑制骨吸收大于骨形成，减少了骨量丢失和骨结构退化，是该药防治骨质疏松症的机理之一。至于健骨二仙提取液最终能否达到增加骨强度、防止骨质疏松性骨折发生的治疗目的，还需要配合生物力学研究，以及长期临床观察该药对预防骨质疏松性骨折的作用。
【】
［１］ 萧劲夫，朱 海，李 昂，等． 益气补肾法防治原发性骨质疏松症． 中医骨伤科杂志，２００１，１０（４）：１－８．
［２］ 程志安，萧劲夫，谢文峰，等． 健骨二仙丸对去势大鼠骨量和血脂的影响． 中国中医骨伤科杂志，２００１，９（５）：１０－１３．
［３］ 施新猷． 医学实验动物学． 西安：陕西技术出版社，１９８９：３６７．
［４］ Ｐｅｔｅｒ Ｖ． Ｎ，Ｒｕｔｈ Ａ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ Ｊ． Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－α ｉｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１３９：２０４８－２０５７．
［５］ 李青南，梁念慈，胡 彬，等． 骨质疏松药物研究指南（美国－ＦＤＡ）的方案简介附去卵巢模型及联合用药．中国骨质疏松杂志， １９９７，３（１）：７５－７８，４２．
［６］ Ｃａｒｌ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ，Ｌｉｓ Ｍｏｓｅｋｉｌｄｅ，Ｂｉｒｇｉｔ Ｓｖｅｎ ｓｔｒｕｐ． Ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｏｎｅ ｍａｓｓ，ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ ｆｅｍａｌｅ ｒａｔｓ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ａｇｅ，ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ，ａｎｄ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ． Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ，１９９３，５２：２６－３３．
［７］ Ｔ． Ｔ． Ａｎｄｒｅａｓｓｅｎ，Ｈ． Ｏｘｌｕｎｄ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｏｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｎｄ ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓ ｂｏｎｅ． Ｊ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ Ｎｅｕｒｏｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔ， ２００１，２（１）：４９－５８．
