青蒿琥酯诱导人前列腺癌PC?3细胞分化及周期阻滞
作者：黄晓飞, 袁丁, 张长城, 张小鹏
【摘要】 探讨青蒿琥酯（artesunate, ART）对人前列腺癌细胞株PC?3分化及周期阻滞的影响。方法：培养人前列腺癌PC?3细胞至对数生长期，ART处理PC?3细胞48 h后，流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测PC?3细胞的细胞周期分布状况，酶联免疫吸附测定法检测细胞培养上清液前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）含量，透射电镜观察细胞形态学变化。结果：与空白对照组比较，ART高剂量组PC?3细胞G0/G1+S期比率减少明显（P<0.05）。ART高剂量组和中剂量组PC?3细胞G2/M比例高于顺铂组和空白对照组（P<0.05）；ART各剂量组细胞上清液中PSA水平均低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05, P<0.01）。透射电镜观察显示细胞胞浆内出现空泡，细胞极性增强，细胞核靠向细胞一侧，对侧的微绒毛明显增多。结论：青蒿琥酯有诱导人前列腺癌PC?3细胞周期阻滞的作用，并能一定程度地诱导前列腺癌PC?3细胞分化。
【关键词】 青蒿琥酯; 前列腺癌; 细胞分化; 细胞周期; 前列腺特异性抗原
Objective: To explore the effect of artesunate (ART) on cell differentiation and cell cycle distribution of the prostate cancer cell line PC?3 in vitro.Methods: PC?3 cells were cultivated with ART from logarithmic growth phase. After 48?hour treatment, the cell cycles were detected by flow cytometry (FCM), and enzyme linked immunosorbent assay was used to detect the level of prostate specific antigen (PSA) in cell culture supernatant. The change of cellular morphology was observed under a transmission electron microscope (TEM). Results: In comparison with the blank control group, the rate of G0/G1 plus S stages of PC?3 cells was significantly decreased in the high?dose ART group. The PC?3 cell was arrested in G2/M by ART. The rates of G2/M of the high?dose ART group and the medium?dose ART group were obviously higher than those of the blank control group and the cisplatin group (P<0.05). The levels of PSA in the three ART groups were significantly lower than that of the normal control group (P<0.05, P<0.01). In the ART groups, TEM showed that some vacuoles appeared in endochylema, cell polarity was enhanced, cell nucleus leaned to one side of the cell, and microvilli increased on the other side of the cell. Conclusion: ART can induce PC?3 cell cycle arrest and differentiation in vitro.
Keywords: artesunate; prostatic neoplasms; cell differentiation; cell cycle; prostate?specific antigen
青蒿琥酯（artesunate, ART）是青蒿素的重要衍生物之一，在临床上主要用于脑型疟疾及各种危重疟疾，具有抗疟活性高和不易耐药等特点。近期研究表明，ART具有抑制白血病、肝癌和乳腺癌等多种肿瘤细胞增殖及诱导细胞分化的作用［1?3］。为深入探讨该药对前列腺癌细胞的作用，我们研究了ART对人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC?3细胞分化与周期阻滞的作用，探讨其抗肿瘤的可能作用机制。
1 材料和方法
1.1 药物与试剂
Ham F?12培养基，Invitrogen公司，批号为1242852；碘化丙啶（propidium iodide, PI）试剂，Sigma公司，批号为094K3731；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批号为060316；注射用青蒿琥酯，桂林南药股份有限公司，批号为050201；注射用顺铂，锦州九泰药业有限公司，批号为050401；胰蛋白酶，Difco公司，批号为050712；注射用青霉素钠和注射用硫酸链霉素，华北制药股份有限公司，批号分别为P0511326和040705。前列腺特异性抗原（prostate specific antigen, PSA）酶联免疫吸附测定（enzyme?linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒，联科生物技术有限公司（Affinity BioReagents, ABR）。
ART，60 mg/支，用所附1 ml 5%碳酸氢钠溶液完全溶解后，用Ham F?12培养液配制成1 mmol/L，－20 ℃保存。实验前解冻，用培养液稀释成实验浓度。注射用顺铂，10 mg/支，用Ham F?12培养液溶解并稀释至25 μmol/L。
1.2 实验仪器
CO2培养箱（美国Nuaire公司，NU4750E型）；流式细胞仪（flow cytometry, FCM）（美国Beckman Coulter公司, EPICSXL型）；透射电镜(日本HITACHI公司，H?7500型)；台式自动平衡离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司，TDZ?4型）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，HS?13000型）。
1.3 细胞培养
人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC?3购自典型培养物保藏中心，使用Ham F?12培养液（含10%灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml链霉素），在37 ℃、5% CO2、饱和水蒸气的CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞进行实验，实验用细胞浓度为5×106/ml。
1.4 流式细胞术检测细胞周期状况
前列腺癌PC?3细胞常规培养，取对数生长期PC?3细胞，分为空白对照组、顺铂组（加顺铂25 μmol/L）和ART高（100 μmol/L）、中（10 μmol/L）、低（1 μ mol/L）浓度组。每组设3个复孔。加入相应的药物培养48 h后，消化收集细胞，PBS洗涤1次后，细胞悬液用预冷的75%乙醇固定，4 ℃过夜。固定后细胞用PBS洗涤1次，加入终浓度为50 μg/ml的RNA酶，置37 ℃水浴作用30 min后，加入PI染液，室温避光染色20 min，流式细胞仪检测细胞周期分布状况，由流式细胞仪自带统计软件细胞周期分布百分率。
1.5 ELISA法检测细胞上清液PSA水平
前列腺癌PC?3细胞常规培养，取对数生长期PC?3细胞，细胞计数后转入24孔板，分空白对照组和ART高、中、低剂量组，每组5孔，每孔500 μl细胞悬液，约含PC?3细胞5×104个，贴壁生长24 h，按分组分别加入不同浓度的ART，培养48 h后，离心取上清，ELISA法检测PSA含量，按试剂说明书进行检测。
1.6 透射电镜观察细胞超微结构变化
PC?3细胞常规培养，取对数生长期细胞（分组同1.4），加入不同浓度的ART，共培养48 h后，消化收集细胞，PBS洗涤1次。细胞沉淀经3％戊二醛前固定，乙醇梯度脱水，1％四氧化锇后固定后，用环氧树脂浸透和包埋。进行超薄切片后，用醋酸铀和柠檬酸铅双染色，透射电镜观察PC?3细胞超微结构的变化。
1.7 统计学方法
计量资料数据用x±s表示，用SPSS 10.0软件包分析，组间显著性检验采用最小显著差异(LSD)法。
2 结 果
2.1 ART对PC?3细胞周期的影响
前列腺癌PC?3细胞用ART培养48 h后，与空白对照组比较，ART低、中和高剂量组PC?3细胞G0/G1+S期比率减少，G2/M期所占比率增加，ART高剂量组PC?3细胞G0/G1+S期比率减少明显（P<0.05）。ART高剂量组和中剂量组PC?3细胞G2/M期比率增加，与空白对照组和顺铂组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。ART小剂量组与空白对照组及顺铂组比较，差异无统计学意义。见表1。表1 ART作用48 h后PC?3细胞周期分布（略）
2.2 ART作用后PC?3细胞培养上清液PSA含量
各浓度ART与前列腺癌PC?3细胞联合培养48 h后，其细胞上清液中PSA含量均低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05, P<0.01）。见表2。表2 ART作用48 h后PC?3细胞培养上清液PSA含量（略）
2.3 ART作用后PC?3细胞的结构变化
空白对照组前列腺癌PC?3细胞的细胞核居中，缺乏极化，细胞膜外微绒毛不明显；经过各浓度ART作用后，胞浆内出现空泡，且细胞极性增强，细胞核靠向细胞一侧，对侧的微绒毛明显增多，细胞分泌功能增强。提示ART对前列腺癌细胞分化有一定的诱导作用。见图1。
3 讨 论
前列腺癌是威胁男性生命的重要疾病，在欧美国家居男性癌症发病率第2位，仅次于肺癌［4, 5］。在我国，随着男性平均年龄的增长，以及进食高脂肪饮食量的增加，前列腺癌的发病率亦呈现逐年上升的趋势，并已成为我国男性常见恶性肿瘤［5］。早期局限性前列腺癌一般采用手术或局部放疗，晚期前列腺癌首选内分泌。但雄激素撤除一段时间后，几乎所有患者病变都将逐渐为雄激素非依赖性前列腺癌。目前尚无有效的治疗手段，严重威胁着患者的生命。
细胞增殖周期失控和细胞去分化是恶性肿瘤细胞的重要特征。因此，抑制肿瘤细胞异常增殖，诱导肿瘤细胞分化及周期阻滞已成为治疗恶性肿瘤的重要思路［6］。本研究结果显示，ART能导致人前列腺癌PC?3细胞发生G2/M期阻滞，且高、中剂量ART对PC?3细胞的G2期阻滞作用优于顺铂（P<0.01）。透射电镜下观察发现ART作用后的前列腺癌PC?3细胞胞浆内出现空泡，细胞极性增强，对侧的微绒毛增多。这些改变提示ART诱导前列腺癌细胞出现分化。
PSA是前列腺上皮细胞产生的糖蛋白，被公认为前列腺癌最主要的血清学标志物［7］。前列腺癌患者经过有效的治疗后，其PSA水平也会显著降低［8］。本研究模拟人体内环境，通过检测前列腺癌上皮细胞系PC?3细胞培养上清液发现，ART和PC?3细胞共培养后，其PSA含量明显下降（P<0.05），且下降趋势与药物浓度成正比。
本实验结果显示，ART有抑制前列腺癌细胞增殖周期和诱导细胞分化的作用，这可能是其抗前列腺癌的机制之一。
【】
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