肝癌小鼠不同阶段有关证候肾上腺差异表达的基因分析
作者：潘志强, 方肇勤, 卢文丽, 梁超, 吴中华, 刘小美, 侯俐, 张辉, 卓少元, 廖明娟, 高必峰
【摘要】 目的：揭示肝癌小鼠不同阶段常见证候肾上腺基因表达的特征。方法：采用实验小鼠及其标准化四诊及辨证方法，以及GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术，检测H22肝癌小鼠早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证共3阶段4个证候肾上腺基因表达的差异，重点关注那些表达量大、差异显著的基因。结果：筛选到不同阶段一致上调的基因73个，一致下调的基因26个。其中一致上调的基因包括Hp、C3、Anxa1、Procr、C2、Il4ra、Cd14、Ptprc、Cd52、C4b以及Eno3、Xdh、Gpx3等。一致下调的基因涉及到神经系统相关基因如Plp1、Mbp、Aldh1a1、Cck和Atn1，与水电解质代谢有关的基因如Aldh1a1和Slc22a17等，与信号转导有关的基因如Cxcr4、Spag5和Stmn3等，以及参与转录调控和蛋白质生物合成的基因，如Hspa1a、Dnajb1、Thra和Hhex等。结论：H22肝癌小鼠在疾病发生过程中，存在证候的演变及肾上腺组织基因表达的差异，不同阶段一致上调或下调的差异表达基因可能是肝癌小鼠及其证候区别于正常小鼠的特征之一。
【关键词】 肝癌 证候 肾上腺 肿瘤分期 基因表达 基因芯片
Methods: By the quantitative four diagnosis and syndrome differentiation methods and GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array, we observed adrenal gland gene expression in H22 tumor mice with pathogenic factor?toxin predominance syndrome and qi deficiency syndrome in the earlier stage, yang?qi deficiency syndrome in the intermediate stage, and qi?yin?yang deficiency syndrome in the advanced stage. Genes highly expressed and remarkably different were analyzed in this study.
Results: A total of seventy?three up?regulated coincident genes and twenty?six down?regulated coincident genes in different stages were investigated in the study. Up?regulated coincident genes included Hp, C3, Anxa1, Procr, C2, Il4ra, Cd14, Ptprc, Cd52, C4b, Eno3, Xdh, Gpx3, and so on. Down?regulated coincident genes included nervous system function?related genes such as Plp1, Mbp, Aldh1a1, Cck, Atn1, genes associated with electrolyte metabolism such as Aldh1a1 and Slc22a17, genes related to signal transduction such as Cxcr4, Spag5 and Stmn3, etc, and genes related to transcriptional control and protein biosynthesis such as Hspa1a, Dnajb1, Thra, Hhex and so on.
Conclusion: With the development of the tumorigenesis, the symptoms and signs and differentially expressed genes in adrenal gland of H22 tumor mice can be measured. Up?regulated and down?regulated coincident genes may be the features of H22 tumor mice different from those of normal mice.
Keywords: liver cancer; symptom complex; adrenal gland; neoplasm staging; gene expression; GeneChip
中医药肿瘤防治讲究辨证论治，这是基于肿瘤患者存在“同病异证”的现象［1, 2］。那么，肿瘤不同证候形成的内在机制是什么呢？以往的研究表明，证候，尤其是虚证，其形成与肾上腺等内分泌器官的功能紊乱与衰退有关；H22肝癌小鼠在肿瘤的发生与发展过程中也存在证候的发生与演变，早期以邪毒壅盛和气虚为主，以后过渡到中期和中晚期的阳气虚、气阴阳虚的复合证，与人类十分相似［3, 4］。因此，检测不同阶段肝癌小鼠肾上腺基因表达谱的改变，有助于深刻认识肿瘤常见证候的内在机制。我们采用小鼠四诊工作站及其系列标准，以及Affymetrix的GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array系统，对H22肝癌小鼠早期邪毒壅盛证（pathogenic factor?toxin predominance syndrome，PTPS）和气虚证（qi deficiency syndrome，QDS）、中期阳气虚证（yang?qi deficiency syndrome，YQDS）和中晚期气阴阳虚证（qi?yin?yang deficiency syndrome，QYYDS）等3个阶段4个常见证候进行了肿瘤、下丘脑、垂体、肾上腺、甲状腺、胸腺、脾脏和睾丸共8个目标组织基因表达谱的检测，本文主要报道荷瘤小鼠3个阶段一致上调或下调的肾上腺基因芯片数据特征。
1 材料与方法
1.1 实验动物 昆明种雄性小鼠270只，体质量（25±1）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物合格证号为SCXK（沪）2003?0003，其中20只腹腔接种H22腹水癌细胞株作为种鼠，腹水形成后抽取腹水用于H22实体瘤接种。H22腹水癌细胞株由上海中医药大学科技实验中心保存。
1.2 实验试剂 TRIzol试剂购自美国GIBCO BRC公司，RNeasy Mini Kit购自德国QIAGEN公司，RNA 6000 Nano LabChip购自美国Agilent Technologies公司，小鼠外显子基因芯片（GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array）及其试剂盒购自美国Affymetrix公司。
1.3 实验仪器
1.3.1 四诊计量化检测设备 YLS?13A型小鼠抓力测定仪（购自山东省医学院设备站）用于抓力检测，底部划有4.5 cm×5.5 cm方格（3行×6列=18格）的实验笼用于旷场检测，NIKON 4500数码相机用于显微和普通拍照、旷场检测录像，3 200 K（色温）250 W摄像专用光源用于显微和普通照明，MP200B型天平（购自上海恒平科学仪器有限公司）用于动物和饲料称质量，数字WMY?01型温度计（购自上海华辰医用仪表有限公司）用于检测腋温，SQF?EA体视显微镜（购自上海万科仪器有限公司）用于爪、尾的显微拍摄，游标卡尺用于肿瘤瘤经的测量，个人电脑用于图像和数据处理。
1.3.2 芯片检测仪器 杂交炉、芯片洗涤系统和芯片扫描仪等购自美国Affymetrix公司。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组及处理 250只正常昆明种小鼠采用随机数字表随机取60只作正常对照，另190只腋下接种H22肿瘤腹水癌细胞0.2 ml（细胞浓度4×107/ml），出瘤后淘汰40只出瘤不佳及畸形小鼠，剩余150只。取正常小鼠20只和肝癌小鼠150只用于四诊计量检测和辨证，另40只正常对照小鼠不做四诊检测（用于早期、中期的正常对照组）。常规饲养。
1.4.2 四诊计量化检测方法与计量辨证方法 我们采用课题组研制的小鼠四诊工作站技术与方法标准采集小鼠四诊信息，主要包括小鼠一般外观表现、体质量、体温、饮水量、摄食量、矿场实验小鼠跨格数、小鼠肢体抓力、爪色泽、尾色泽和肿瘤瘤径等指标，然后进行计量化辨证。可参见有关［5, 6］。
1.4.3 肝癌小鼠分期与常见证候的确定 H22肝癌小鼠分期标准参见有关文献［4］。分别于接种肿瘤后第7天（早期）、第20天（中期）和第28天（中晚期）进行全体小鼠四诊检测与辨证，并分别于检测后的次日，即接种肿瘤后第8天，辨证并筛选出最为典型的邪毒壅盛证和气虚证小鼠各16只；第21天，辨证并筛选出最为典型的阳气虚证小鼠16只；第29天，辨证并筛选出最为典型的气阴阳虚证小鼠16只。
1.4.4 不同证候肝癌小鼠的处死与取材 小鼠四诊检测与辨证后处死，分别取下丘脑、垂体、甲状腺、肾上腺、睾丸、胸腺、脾脏和肿瘤组织。称质量和各组织与正常对照小鼠对应组织质量均数的比值。
1.4.5 RNA的提取与检测 以上共5组样本采用TRIzol（GIBCO BRC）试剂盒及其方法，抽提肾上腺组织总RNA，16个组织样本合并混匀；采用RNeasy Mini Kit（QIAGEN）试剂盒及其方法纯化RNA；采用RNA Nano LabChip和方法，及其配套的Agilent?bioanalizer 2100芯片检测RNA的质量和电泳图谱。
1.4.6 芯片检测 采用GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array及其试剂盒所建议的检测方法，采用iterPlier法计算核心基因表达读数值，并作外显子剪接差异分析。以上RNA检测和芯片检测委托上海生物芯片有限公司完成。
1.4.7 不同阶段肾上腺一致上调或下调基因的筛选 筛选标准为：（1）筛选4个证候与正常组比值至少有1组大于或等于2.0，及小于或等于0.5的基因；（2）一致上调的基因，进一步筛选4个证候与正常组比值均大于1.5者；（3）一致下调的基因，进一步筛选4个证候与正常组比值均小于0.67者；（4）一致上调或下调的高表达基因，本文重点分析步骤（2）和（3）中至少有1组读数大于或等于1 000的基因。
2 结果
2.1 肝癌小鼠肾上腺差异表达的基因数 在芯片16 661个核心基因中，采用以上筛选条件，得到肿瘤发生后，不同阶段肾上腺一致上调的基因73个，一致下调的基因26个。
2.2 肝癌小鼠肾上腺一致上调的基因
2.2.1 肝癌早期小鼠肾上腺一致上调的基因 肝癌早期小鼠肾上腺组织中上调的基因有19个（表1），其中邪毒壅盛证有16个（表1前16个），气虚3个（表1后3个）。其表达量大于中期和中晚期。
2.2.2 肝癌中期小鼠肾上腺上调的基因 肝癌中期阳气虚证小鼠肾上腺组织中上调，且在4个证候中表达量最高的基因有12个。见表2。
2.2.3 肝癌中晚期小鼠肾上腺上调的基因 中晚期气阴阳虚证上调，且在4个证候中表达量最高的基因有30个，见表3。
2.2.4 早期至中晚期逐步上调的基因 这类基因共有12个。其特点是在早期，包括邪毒壅盛证和气虚证，这些基因表达业已升高；随着疾病的发展，其表达进一步增加。见表4。
2.3 肝癌小鼠肾上腺一致下调的基因 通过以上筛选方法，获得肾上腺中表达一致下调的基因共26个。
2.3.1 肝癌早期小鼠肾上腺一致下调的基因 早期一致下调的基因有9个，其中邪毒壅盛证有3个，气虚证6个。其表达量小于中期和中晚期。见表5。
表1 早期邪毒壅盛和气虚证上调显著的基因（芯片读数计算值）（略）
Table 1 Up?regulated genes of mice with PTPS and QDS in earlier stage
表2 中期阳气虚证上调显著的基因（芯片读数计算值）（略）
Table 2 Up?regulated genes of mice with YQDS in intermediate stage
表3 中晚期气阴阳虚证上调显著的基因（芯片读数计算值）（略）
Table 3 Up?regulated genes of mice with QYYDS in advanced stage
表4 早期至中晚期逐步上调的基因（芯片读数计算值）（略）
Table 4 Gradually up?regulated genes of mice from earlier stage to advanced stage
表5 早期邪毒壅盛和气虚证一致下调显著的基因（芯片读数计算值）（略）
Table 5 Down?regulated genes of mice with PTPS and QDS in earlier stage
2.3.2 肝癌中期小鼠肾上腺下调的基因 中期阳气虚证下调，且在4个证候中表达量最低的基因有11个。见表6。
2.3.3 肝癌中晚期小鼠肾上腺下调的基因 中晚期气阴阳虚证下调，且在4个证候中表达量最低的基因有6个。见表7。
表6 中期阳气虚证下调显著的基因（芯片读数计算值）（略）
Table 6 Down?regulated genes of mice with YQDS in intermediate stage
表7 中晚期气阴阳虚证下调显著的基因（芯片读数计算值）（略）
Table 7 Down?regulated genes of mice with QYYDS in advanced stage
3 讨论
3.1 肝癌小鼠肾上腺一致上调基因的功能 这类基因在肝癌小鼠肾上腺中扮演什么角色呢？遗憾的是经文献检索，这些基因以往研究大多未涉及到肾上腺，是在其他组织研究中发现，并初步观察其作用的。依据文献报道，有两类基因比较集中。
（1）参与炎症反应、防御应答和补体激活途径等与免疫功能相关的基因。如：Hp、C3、Anxa1、Procr、C2、Il4ra、Masp1、Cd14、Ptprc、Cd52、C4b、Kng1、S100a8、Ltf和Mpo等。其中一些基因在正常情况下便有表达，表达量大，如Hp和C3；而Cd14、Ptprc、Cd52、C4b和S100a8等基因在正常小鼠表达较低，有的近乎不表达，但肿瘤发生后，这些基因表达异常活跃，如S100a8由正常读数的59到中晚期读数高达6 140。
触珠蛋白（Hp）被称为急性期炎性反应蛋白，在炎症、外伤急性期明显升高［7］。Procr又称为Epcr，主要表达于大动脉和大静脉腔内皮细胞表面，参与抗凝、抗炎症、抗凋亡及自身免疫，最近发现还可在多种肿瘤细胞表达，是肿瘤细胞表面发现的又一种与抗凝相关的蛋白［8］。补体C3主要由肝细胞和巨噬细胞产生，是补体系统的中枢，参与并调节细胞免疫应答。膜联蛋白A1（Anxa1）又称为磷脂酶A2抑制蛋白，它与细胞增殖、分化、凋亡、信号转导、膜融合和炎症等相关。研究表明Anxa1与肿瘤的发生、发展、诊断及密切相关［9］。我们的研究发现，C3和Anxa1在肿瘤发生后，肾上腺中的表达量呈现逐渐升高趋势。
Il4ra由活化的T 细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞合成分泌，主要参与调节T淋巴细胞的生长、繁殖和分化［10］。Cd14是一种特异性的单核细胞和巨噬细胞细胞表面标记物，主要生物学活性是作为内毒素脂多糖受体，在机体免疫、防御系统引起的一系列病理反应中起关键作用［11］。Ptprc又称为Cd45，是位于白细胞表面的白细胞共同抗原，主要参与活化信号转导、淋巴细胞发育和T细胞活化等的调节作用，此外，Cd45还参与B细胞的分化等多种免疫功能［12］。Cd52 抗原是分布在淋巴细胞及淋系肿瘤细胞上的一种糖基磷脂酰肌醇锚定糖蛋白抗原，其分子交联化可引起一系列信号传导，但直接功能至今还不清楚［13］。髓过氧化物酶（Mpo）是由活化的吞噬细胞分泌的一种血红素蛋白，也是髓细胞的特异性标志［14］。
肝癌小鼠肾上腺没有炎症，为什么这类基因会表达如此活跃呢？是机体整体免疫反应在肾上腺中的反映，还是这些基因在肾上腺中可能扮演着其他角色呢？有待进一步研究。
（2）涉及到许多酶。如Eno3、Xdh、Adh7、Gpx3、Dusp6、Gpam、Pex16、Adamts1、Usp53、Dusp16、Pex5、Nnmt、Alas2、Gda、Plau、Arhgap28和Mmp8等。其中Adamts1、Mmp8、Plau参与蛋白质水解等过程，Dusp6、Dusp16参与蛋白氨基酸去磷酸化等，Pex5参与蛋白质运输，Usp53参与泛素依赖蛋白分解代谢等过程。Eno3参与糖酵解，Xdh参与电子传递过程，Gpx3参与过氧化氢分解代谢。Alas2、Gpam、Pex16参与血红素和磷脂等生物合成。Gda和Adh7参与核苷酸、核酸代谢及调控转录等。
以上这些酶相关基因，部分如Eno3、Xdh、Adh7、Gpx3、Dusp6和Gpam在正常小鼠肾上腺表达较高，当肿瘤发生后，其表达量更是增加达2倍。提示肿瘤发生后，肾上腺部分生物大分子的合成、分解、代谢十分活跃。这些酶的变化与肿瘤分期没有显著的关系，更可能与疾病有关。
初步分析发现，Fpr?rs7、Pmp2、Atxn7和Plau等基因在肿瘤早期邪毒壅盛证表达很高；而S100a8、4930486L24Rik、Lcn2、S100a9、Ltf、Ngp、Mmp8和Chi3l3等基因在中期和中晚期表达非常高，在正常小鼠表达却十分低。这些基因是否是不同阶段、不同证候的标志基因？其病理意义如何？值得进一步关注。
3.2 肝癌小鼠肾上腺一致下调基因的功能 这类基因下调幅度大，主要涉及到以下几类基因。
（1）与神经系统功能相关的基因。如Plp1、Mbp、Aldh1a1、Snap25、Cck、Atn1、Stmn3等。这类基因以往研究集中在神经系统。那为什么在肾上腺表达会出现如此的变化呢？可能是因为肾上腺髓质由外胚层的神经嵴细胞迁移而来，人胚胎自7周起，第18～24对体节水平的神经嵴细胞迁入肾上腺皮质原基而分化为肾上腺嗜铬细胞，使肾上腺髓质与交感神经细胞同源。由此推断，这类基因可能在肾上腺髓质表达。值得注意的是，这些基因在正常小鼠肾上腺内表达均很高，显得很重要，当肿瘤形成后，其表达量大幅度下降。
如Plp1基因正常小鼠肾上腺芯片读数为5 219，提示为高表达基因，在肿瘤形成全过程中，Plp1基因表达量比正常小鼠降低10多倍。Plp1基因编码髓鞘蛋白脂蛋白，在中枢神经系统中含量最丰富，并在其发育过程中起到十分重要的作用［15］。Mbp基因在正常小鼠肾上腺芯片读数为4 248，在肿瘤形成全过程中，Mbp基因表达量比正常小鼠降低竟达20余倍，几乎被关闭。Mbp是组成髓鞘的主要蛋白之一，主要参与突触传递、中枢神经系统发育、神经入鞘及免疫应答等［16］。Cck基因在正常小鼠肾上腺芯片读数为1 933，肿瘤发生后各期，Cck表达量降低也达10倍之多。Cck编码缩胆囊素，是具有广泛生物学活性的脑肠肽，它既是胃肠道主要调节激素之一，参与摄食、胰岛素的释放、胃肠运动、镇痛、情绪等活动的调节；也作用于中枢神经系统，起着神经递质或调质的作用［17］。
（2）参与水电解质代谢的基因，如Aldh1a1、Slc22a17、Atp1a3、Atp1b2等。推测这些基因可能是由肾上腺皮质所表达，提示肿瘤发生后，肾上腺参与调节水电解质代谢的基因表达下降，导致机体水电解质平衡紊乱。
其中，Aldh1a1基因参与醛代谢，正常小鼠肾上腺芯片读数为3 346，随着肿瘤的，其表达量下降2～3倍。值得注意的是，与此相反，肾上腺皮质类固醇醛固酮合成酶Cyp11b2表达却逐渐升高，反映了机体醛固酮合成增多与代谢减少的一致。Slc22a17、Atp1a3、Atp1b2等基因参与钾和钠离子的运输，随着肿瘤的发生发展，这些基因表达呈现逐渐下降的趋势，提示肿瘤小鼠水电解质代谢调节功能紊乱。
（3）参与信号转导的基因。诸如Cxcr4、Cck、Spag5、Stmn3等。Cxcr4被发现是T细胞?嗜性HIV?1的主要辅助受体，主要参与信号转导、G蛋白偶联受体蛋白信号转导途径等。研究表明Cxcr4在炎症反应、HIV感染，以及调控免疫细胞分化、发育及定向迁移过程中起重要作用，且在心脏、血细胞、血管和神经的发育、损伤的修复及肿瘤的生长恶化中起一定作用［20］。正常小鼠肾上腺芯片读数为3 022，在肿瘤形成全过程中，Cxcr4基因表达量比正常小鼠降低2倍左右。Spag5主要参与磷酸肌醇介导的信号转导、细胞周期、有丝分裂、纺锤体组织和生物发生等生物过程。正常小鼠肾上腺芯片读数为1 716，在肿瘤形成全过程中，Spag5基因表达量比正常小鼠降低3～5倍。Cck与Stmn3基因也参与了细胞内信号转导级联反应等。有研究表明Cck?8可剂量依赖性地激活静息状态和LPS诱导的大鼠PMs cAMP?PKA信号转导途径，并认为这可能是Cck抗炎作用的分子机制之一［21］。
（4）参与转录调控、蛋白质生物合成及其折叠等的基因。如Hspa1a、Dnajb1、Thra、Hhex等。其中Hspa1a编码70 kD热休克蛋白（Hsp70）1A。Hsp70具有多种生物学功能，包括分子伴侣功能，参与免疫反应，抗细胞凋亡功能，抗氧化功能，提高细胞的应激耐受性，促进细胞增殖，参与细胞骨架的形成和修复等等［22］。Dnajb1基因又称为Hsp40，被认为可以对Hsp70 ATP酶的活性起到重要的调节作用。Dnajb1在小鼠睾丸中持续性表达，其表达水平不受热休克而改变［23］。Thra即α型甲状腺激素受体。
此外，值得注意的是，H3 histone, family 3B基因在正常小鼠表达量高达13 992，而肝癌小鼠早期的邪毒壅盛证、气虚证和阳气虚证中表达急剧下降，下调倍数达100倍。在阴阳气虚证中下调也有2倍，这种情况与证候有关，还是其他原因所致，尚有待于深入研究。研究表明H3 histone是染色体的结构蛋白，它与DNA 组成的核小体是染色体的基本结构单元，组蛋白的功能是协助折叠及包装DNA，保护DNA 不被酶消化，除此之外，它还在基因调控、肿瘤形成、细胞凋亡中起到重要作用［24］。
总之，以上这些基因表达的改变，标志着肾上腺整体生理机能的减退，也表明了这些基因表达的改变与肿瘤相关、与疾病相关，是疾病导致了这些基因表达的改变。但是，值得注意的是，即便如此，在早期、中期、中晚期3个不同阶段，不同组别基因表达高低存在差异；即使在早期这同一阶段，邪毒壅盛和气虚也存在基因表达的差异。这提示这些基因表达数量的改变，还可能与证候有着密切的关系，部分基因可能即是证候形成的内在基础。我们希望今后能进一步探讨、检验、揭示这些基因与肿瘤不同证候的关系。
3.3 采用基因芯片技术研究中医证候的考虑
将基因芯片技术引入中医证候的研究中，可以全面、客观、真实地反映不同证候在不同组织中基因转录的整体特征，这样的研究，对于深入认识疾病?证候的本质是必要的，这也还为今后深入研究开拓了广阔的视野和空间。以往由于受到检测手段的限制，中医证候研究往往局限在肾上腺轴的几个基因、蛋白或激素。那么，究竟是如何导致这些基因表达改变的，还有没有其他基因的表达发生显著的改变？显然，仅仅对若干基因的观察，会遗漏许多重要的生物信息，而且对全面综合评价目标组织基因表达改变特征是不利的。本文主要分析了小鼠肾上腺基因芯片的表达特征，是基于以往学术界在证候研究中发现神经内分泌组织与证候尤其是虚证的关系密切。最近，沈自尹等［25］对衰老大鼠肾虚证模型及皮质酮大鼠肾阳虚证模型采用大鼠全基因组芯片检测下丘脑、垂体、肾上腺、淋巴细胞（HPAT）组织基因表达谱，结果老年大鼠和皮质酮大鼠与青年大鼠比较，在HPAT轴上首先是众多的神经递质显著下调，接下来是生长激素类和性激素类都显著下调，其表达下调的模式呈高度一致。该研究采用基因芯片技术筛选肾虚证的部分特征性基因，并观察给予中药干预后的改变。
基因芯片结果是否可靠，是不是需要采用RT?PCR等手段逐一验证呢？对于那些将要深入研究的基因，前期的验证是必须的。然而，就研究方法而言，以上结果是可靠的。首先，我们所观察的肝癌小鼠4个常见证候，以及所建立的小鼠四诊工作站及其标准，业已通过大量重复的实验验证，是稳定且可重复的；其次，本实验采用16只小鼠的样本合并，反映了不同阶段肝癌小鼠基因表达的集中趋势，不是个别小鼠可能带来的误差；再次，Affymetrix的GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array具有一套标准的操作方法和不同环节的质量检测与控制，芯片扫描结果也采用了一系列内在质量检验与控制，经检查，以上芯片检测 各环节和结果质量是稳定的。因此，可以说以上所观察的结果是可靠的。
关于不同证候的基因芯片数据分析，面对如此大量的数据结果，如何取舍是重要的选择。我们首先公布那些表达量较大的基因。这是因为我们以往的研究一再发现，那些表达量大的基因，往往具有比较重要的生理功能和病理意义。所以我们把芯片读数在1 000以上的基因入选（至少1组），希望能够集中反映那些具有比较重要功能的基因。对于以上所筛选获得的一些差异表达基因，我们将开展实验进行验证，以揭示H22肝癌荷瘤小鼠证候的物质基础。
【】
1 Fang ZQ, Li YJ, Tang CL, et al. Analysis on characteristics of syndrome in 2 060 cases of primary hepatic cancer. Zhong Yi Za Zhi. 2004; 45(1): 53?54. Chinese with abstract in English.
方肇勤, 李永健, 唐辰龙, 等. 2 060例原发性肝癌患者证候特点分析. 中医杂志. 2004; 45(1): 53?54.
2 Li YJ, Fang ZQ, Tang CL, et al. The study of clinical epidemiology of symptoms and signs about 2 060 primary hepatic carcinoma's distribution of TCM syndrome. Zhongguo Yi Yao Xue Bao. 2003; 18(3): 144?146. Chinese with abstract in English.
李永健, 方肇勤, 唐辰龙, 等. 2 060例原发性肝癌中医证候分布的临床流行病学调查研究. 医药学报. 2003; 18(3): 144?146.
3 Fang ZQ, Hou L, Lu WL, et al. Occurrence, development, accompanying symptoms and prognosis of syndromes in tumor?bearing mice. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi. 2007; 41(1): 57?62. Chinese with abstract in English.
方肇勤, 侯俐, 卢文丽, 等. 荷瘤小鼠证候的发生、演变、兼证及预后. 上海中医药杂志. 2007; 41(1): 57?62.
4 Fang ZQ. The experiment technology of determination of treatment based on pathogenesis obtained through differentiation of symptoms and signs—experiment mouse technique of diagnosis and differentiation of symptoms and signs. Shanghai: Shanghai Scientific and Techincal Publishers. 2006: 45, 132?153. Chinese.
方肇勤. 辨证论治实验方法学—实验小鼠诊法和辨证. 上海: 上海技术出版社. 2006: 45, 132?153.
5 Fang ZQ, Pan ZQ, Tang WC, et al. Construction and operational standard of four diagnostic methods workstation for mice. Shanghai Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 2006; 20(1): 42?46. Chinese with abstract in English.
方肇勤, 潘志强, 汤伟昌, 等. 小鼠“四诊工作站”构建与操作标准探讨. 上海中医药大学学报. 2006; 20(1): 42?46.
6 Fang ZQ, Pan ZQ, Lu WL, et al. Establishment and evaluation of metrological methods of syndrome differentiation about common syndrome in rats and mice. Zhongguo Zhong Yi Ji Chu Yi Xue Za Zhi. 2007; 13(7): 502?505. Chinese with abstract in English.
方肇勤, 潘志强, 卢文丽, 等. 大鼠、小鼠常见证候计量化辨证及方法的建立及其评价. 中国中医基础医学杂志. 2007; 13(7): 502?505.
7 Wang Y, Kinzie E, Berger FG, et al. Haptoglobin, an inflammation?inducible plasma protein. Redox Rep. 2001; 6(6): 379?385.
8 Zheng X, Li W, Gu JM, et al. Effects of membrane and soluble EPCR on the hemostatic balance and endotoxemia in mice. Blood. 2007; 109(3): 1003?1009.
9 Bensalem N, Ventura AP, Vallée B, et al. Down?regulation of the anti?inflammatory protein annexin A1 in cystic fibrosis knock?out mice and patients. Mol Cell Proteomics. 2005; 4(10): 1591?1601.
10 Soriano A, Lozano F, Oliva H, et al. Polymorphisms in the interleukin?4 receptor alpha chain gene influence susceptibility to HIV?1 infection and its progression to AIDS. Immunogenetics. 2005; 57(9): 644?654.
11 Benhnia MR, Wroblewski D, Akhtar MN, et al. Signaling through CD14 attenuates the inflammatory response to Borrelia burgdorferi, the agent of Lyme disease. J Immunol. 2005; 174(3): 1539?1548.
12 Irles C, Symons A, Michel F, et al. CD45 ectodomain controls interaction with GEMs and Lck activity for optimal TCR signaling. Nat Immunol. 2003; 4(2): 189?197.
13 Ito K, Hasegawa A, Komori S, et al. Biochemical property and immunogenicity of mouse male reproductive tract CD52 (mrt?CD52). J Reprod Immunol. 2007; 75(1): 32?39.
14 Eiserich JP, Baldus S, Brennan ML, et al. Myeloperoxidase, a leukocyte?derived vascular NO oxidase. Science. 2002; 296(5577): 2391?2394.
15 Simons M, Kramer EM, Macchi P, et al. Overexpression of the myelin proteolipid protein leads to accumulation of cholesterol and proteolipid protein in endosomes/lysosomes: implications for Pelizaeus?Merzbacher disease. J Cell Biol. 2002; 157(2): 327?336.
16 Galiano MR, Andrieux A, Deloulme JC, et al. Myelin basic protein functions as a microtubule stabilizing protein in differentiated oligodendrocytes. J Neurosci Res. 2006; 84(3): 534?541.
17 Giacobini P, Wray S. Cholecystokinin directly inhibits neuronal activity of primary gonadotropin?releasing hormone cells through cholecystokinin?1 receptor. Endocrinology. 2007; 148(1): 63?71.
18 Molotkov A, Duester G. Genetic evidence that retinaldehyde dehydrogenase Raldh1 (Aldh1a1) functions downstream of alcohol dehydrogenase Adh1 in metabolism of retinol to retinoic acid. J Biol Chem. 2003; 278(38): 36085?36090.
19 Shen Y, Lee G, Choe Y, et al. Functional architecture of atrophins. J Biol Chem. 2007; 282(7): 5037?5044.
20 Xu J, Mora A, Shim H, et al. Role of the SDF?1/CXCR4 axis in the pathogenesis of lung injury and fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 2007; 37(3): 291?299.
21 Li S, Ni Z, Cong B, et al. CCK?8 inhibits LPS?induced IL?1beta production in pulmonary interstitial macrophages by modulating PKA, p38, and NF?kappaB pathway. Shock. 2007; 27(6): 678?686.
22 Carsillo T, Traylor Z, Choi C, et al. hsp72, a host determinant of measles virus neurovirulence. J Virol. 2006; 80(22): 11031?11039.
23 Doiguchi M, Kaneko T, Urasoko A, et al. Identification of a heat?shock protein Hsp40, DjB1, as an acrosome? and a tail?associated component in rodent spermatozoa. Mol Reprod Dev. 2007; 74(2): 223?232.
24 Witt O, Albig W, Doenecke D. Transcriptional regulation of the human replacement histone gene H3.3B. FEBS Lett. 1997; 408(3): 255?260.
25 Shen ZY, Huang JH, Chen WH. Comparison of gene expression profiles between rats of Shen deficiency syndrome and Shen?yang deficiency syndrome differentiated according to therapeutic efficacy of drugs used. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2007; 27(2): 135?137. Chinese with abstract in English.
沈自尹, 黄建华, 陈伟华. 以药测证对肾虚和肾阳虚大鼠基因表达谱的比较研究. 中国中西医结合杂志. 2007; 27(2): 135?137.
