辛夷挥发油抑制糖尿病肾病大鼠血清及肾组织P?选择素蛋白表达
作者：孙雪鹏, 汪年松, 薛勤, 王锋
【摘要】 目的：观察辛夷挥发油对糖尿病模型大鼠血清及肾组织中P?选择素蛋白表达的影响，探讨其对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制。
方法：50只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和辛夷挥发油大、中、小剂量组。通过1次性腹腔注射1%链脲佐菌素复制1型糖尿病大鼠模型，造模前后及成模后第4、8、12周检测各组大鼠的随机血糖（random blood glucose, RBG）和24 h尿微量白蛋白；第12周取血检测血尿素氮和血肌酐；光镜（PAS染色）观察大鼠肾组织病理变化；酶联免疫吸附测定法检测大鼠血清可溶性P?选择素蛋白表达，免疫组织化学法检测大鼠肾组织中P?选择素蛋白表达。
结果：与正常对照组相比，模型组RBG、24 h尿微量白蛋白、血尿素氮、血清可溶性P?选择素水平和肾组织中P?选择素蛋白表达均升高（P<0.01），血肌酐降低（P<0.01），病理改变较明显。辛夷挥发油各治疗组24 h尿微量白蛋白、血清可溶性P?选择素水平和肾组织中P?选择素蛋白表达均较模型组显著降低（P<0.01），病理改变亦较模型组轻。但辛夷挥发油各浓度组间差异无统计学意义（P>0.05）。
结论：辛夷挥发油可能通过抑制糖尿病大鼠血清及肾组织中P?选择素蛋白表达发挥对肾脏的保护作用。
【关键词】 糖尿病肾病; P?选择素; 辛夷; 油类, 挥发; 大鼠
Objective: To investigate the protection mechanism of volatile oil of Magnolia biondii Pamp. (VOMBP) against diabetic nephropathy in rats by observing its effects on level of soluble P?selectin (sP?selectin) in serum and expression of P?selectin in renal tissue.
Methods: Fifty SD rats were randomly divided into normal control group, untreated group, and low?, medium? and high?dose VOMBP?treated group. Diabetic nephropathy was induced in rats by intraperitoneal injection of 1% streptozotocin. Before and the 1st day, 4th, 8th and 12th week after the induction, random blood glucose (RBG) and 24?hour urinary micro?albumin were detected in different groups. At the 12th week, the rats were sacrificed to collect the blood samples and renal tissues. The contents of blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (SCr) were detected and the pathological change in renal tissues was observed by light microscope; the level of sP?selectin was detected by enzyme?linked immunosorbent assay and the expression of P?selectin protein in renal tissues was measured by immunohistochemical method.
Results: Compared with the normal control group, RBG, 24?hour urinary micro?albumin, the contents of BUN, sP?selectin in serum and expression of P?selectin protein in renal tissue in the untreated group were significantly increased (P<0.01), the content of SCr was significantly decreased (P<0.01), and pathological change of renal tissues was also obvious. Compared with the untreated group, 24?hour urinary micro?albumin, the level of sP?selectin in serum and expression P?selectin protein in renal tissue of the three VOMBP?treated groups were all significantly decreased (P<0.01), and pathological change was lessened too. However, there were no significant differences among the three VOMBP?treated groups (P>0.05).
Conclusion: VOMBP can protect the kidney in rats with diabetic nephropathy by inhibiting the expressions of P?selectin protein in serum and in renal tissue.
Keywords: diabetic nephropathy; P?selectin; Magnolia biondii Pamp; oils, volatile; rats; diabetes mellitus
糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病（diabetes mellitus, DM）最常见和最严重的慢性微血管并发症之一，近年来已成为终末期肾脏疾病（end?stage renal disease, ESRD）的主要原因。炎症机制［1］是当前研究DN发病机制的新热点，其中黏附分子，P?选择素表达水平的显著升高在该病炎症发病机制中起到了关键的作用，因此抑制其表达将可能成为DN治疗的新途径。在中医病机方面，“久病入络”、“肾络癥瘕”［2］和“毒损肾络”［3］等微观病机学说，均涉及到络病机制在该病中的核心作用。因此有学者提出以络病机制作为传变的中心环节，探讨DN的发生发展［4, 5］。我们发现从传统中药辛夷Magnolia biondii Pamp.(河南南召产的望春玉兰)中提取的有效成分辛夷挥发油（volatile oil of Magnolia biondii, Pamp. VOMBP）具有可靠的抗炎效应［6?8］，其性味辛温，气味芳香，又具有通络的作用。本研究拟通过链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导的1型糖尿病大鼠模型，观察辛夷挥发油对糖尿病大鼠血清和肾组织中P?选择素蛋白表达的影响，从微观领域及中西医结合的角度探索其对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物模型及分组 雄性清洁级SD大鼠50只，体质量（250±20）g，由院上海实验动物中心提供，许可证号为SCXK(沪)2002?0010。标准饲料适应性喂养1周后，采用随机数字表法随机分为正常对照组、模型组和辛夷挥发油（河南南召华龙辛夷开发有限责任公司生产，批号20060928）大、中、小剂量组，每组10只。造模前禁食不禁水12 h，模型组和辛夷挥发油各治疗组1次性腹腔注射1％ STZ（55 mg/kg）（Sigma公司）枸橼酸缓冲液；正常对照组1次性腹腔注射等量的枸橼酸缓冲液。72 h后连续3 d测随机血糖（random blood glucose, RBG），以血糖≥16.7 mmol/L为模型成功标准。辛夷挥发油各治疗组按辛夷挥发油大（0.28 ml/kg）、中（0.14 ml/kg）和小（0.07 ml/kg）剂量分别灌胃3％辛夷挥发油药液，1次/d，实验期间所有大鼠均予标准饲料喂养，自由饮水，不用胰岛素控制血糖，用药持续12周。
1.2 标本采集和指标检测 各组大鼠于造模前、模型成功后第1天（注射1％ STZ 72 h后）及第4、8、12周割尾采血，罗氏血糖仪及配套试纸条检测RBG，代谢笼收集24 h尿液，用德灵BMⅡ型自动分析仪检测24 h尿微量白蛋白，散射比浊法试剂由德灵公司提供；第12周处死大鼠，腹主动脉采血，取2 ml检测血尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）及血肌酐(serum creatinine, SCr)；另取2 ml静置30 min，高速（3 000 r/min，15 min）离心后分离血清，置－20 ℃冰箱保存，用于酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测血清可溶性P?选择素水平；摘取肾脏，将其纵向剖开，置于10%甲醛标本固定液中，1周后用于病理切片及免疫组化检测。
1.3 肾脏病理形态学变化 2～3 μm石蜡切片行PAS染色。光镜下观察肾小球基底膜及系膜基质增生情况。
1.4 ELISA检测各组大鼠血清可溶性P?选择素浓度 用ELISA试剂盒（华美生物技术公司产品）检测各组大鼠血清可溶性P?选择素浓度，建立标准曲线，每孔加入待测样品100 μl，充分混匀后置37 ℃孵育120 min；洗板后除空白孔外每孔加入一抗工作液50 μl，置37 ℃孵育60 min；洗板后除空白孔外每孔加酶标抗体工作液100 μl，再置37 ℃孵育60 min；洗板并加入底物A和B置37 ℃孵育30 min，每孔加50 μl终止液，在450 nm处检测吸光度值。根据标准曲线得到样品中可溶性P?选择素浓度。
1.5 免疫组化法检测各组大鼠肾组织P?选择素蛋白表达 3 μm厚石蜡切片常规脱蜡和水化，用含3%过氧化氢（H2O2）的PBS封闭内源性过氧化物酶；然后依次加入一抗和辣根过氧化物酶标记的二抗（美国Santa Cruz公司试剂）；最后二氨基联苯胺显色，苏木素复染，显微镜下观察，软件分析免疫组化图像中阳性区域面积和阳性比率，摄像。每张切片至少分析3个视野。
1.6 统计学方法 计量资料实验数据以x±s表示，应用SPSS 13.0统计软件，进行多组间单因素方差分析。P<0.05表明差异有统计学意义。数据为非正态分布时进行对数和平方根转换。
2 结果
2.1 各组大鼠随机血糖 与正常对照组相比，造模成功后至实验结束时模型组和辛夷挥发油各治疗组血糖均明显升高（P<0.01）；辛夷挥发油各治疗组与模型组之间血糖差异无统计学意义（P>0.05）；辛夷挥发油各治疗组间血糖差异亦无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠24 h尿微量白蛋白 与正常对照组相比，造模成功后模型组及辛夷挥发油各治疗组24 h尿微量白蛋白即明显上升（P<0.01）；第12周时，与模型组相比，辛夷挥发油各治疗组24 h尿微量白蛋白水平显著降低（P<0.01）；但辛夷挥发油各治疗组间差异并无统计学意义（P>0.05）。见表2。
表1 各组大鼠随机血糖（略）
Table 1 Random blood glucose of rats in different groups
** P<0.01, vs normal control group.
表2 各组大鼠24 h尿微量白蛋白（略）
Table 2 24?hour urinary micro?albumin of rats in different groups
**P<0.01, vs normal control group; △△P<0.01, vs untreated group.
2.3 各组大鼠BUN和SCr含量 第12周时，与正常对照组相比，模型组和辛夷挥发油各治疗组血尿素氮均明显升高（P<0.01）；与模型组相比，辛夷挥发油各治疗组血尿素氮有下降趋势，但差异尚无统计学意义。与正常对照组相比，模型组和辛夷挥发油各治疗组血肌酐水平显著降低（P<0.01），而辛夷挥发油各治疗组与模型组之间血肌酐水平并无明显差异（P>0.05）；辛夷挥发油各治疗组间血尿素氮及血肌酐水平差异亦无统计学意义（P>0.05）。见表3。
表3 第12周时各组大鼠BUN和SCr含量（略）
Table 3 Contents of BUN and SCr in rats in different groups at the 12th week
** P<0.01, vs normal control group.
2.4 各组大鼠肾脏病理改变 光镜下与正常对照组比较，模型组肾小球毛细血管基底膜明显增厚，系膜基质明显增多，辛夷挥发油各治疗组肾小球毛细血管基底膜和系膜基质增生较轻；与模型组比较，辛夷挥发油各治疗组肾小球毛细血管基底膜和系膜基质均明显减少；辛夷挥发油大、中剂量治疗组差异不明显，小剂量治疗组肾小球基底膜及系膜基质增生较前两组明显。见图1。
2.5 各组大鼠血清中可溶性P?选择素 与正常对照组相比，模型组血清中可溶性P?选择素浓度显著升高（P<0.01）；辛夷挥发油中剂量组血清中可溶性P?选择素浓度显著降低（P<0.01）。与模型组相比，辛夷挥发油大剂量组和中剂量组可溶性P?选择素浓度显著降低（P<0.01）；小剂量治疗组有下降趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。与辛夷挥发油小剂量治疗组相比，中剂量治疗组可溶性P?选择素浓度显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。见表4。
2.6 各组大鼠免疫组化检测结果 与正常对照组相比，模型组大鼠肾组织P?选择素蛋白表达显著升高（P<0.01），辛夷挥发油各治疗组P?选择素蛋白表达有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组相比，辛夷挥发油各治疗组肾组织P?选择素蛋白表达均显著降低（P<0.01），辛夷挥发油各治疗组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表4和图2。
图1 各组大鼠肾脏病理切片结果（PAS染色，×200）（略）
Figure 1 Results of pathological section of kidney in rats in different groups (PAS staining, ×200）
A: Normal control group; B: Untreated group; C: Low?dose VOMBP?treated group; D: Medium?dose VOMBP?treated group; E: High?dose VOMBP?treated group.
表4 12周时各组大鼠血清中可溶性P?选择素含量及肾组织中P?选择素蛋白表达情况（略）
Talbe 4 Content of sP?selectin in serum and expressin of P?selectin protein in renal tissue of rats in different groups at the 12th week
** P<0.01, vs normal control group; △△P<0.01, vs untreated group; ▲▲P<0.01, vs medium?dose VOMBP?treated group.
图2 各组大鼠肾脏P?选择素蛋白表达（免疫组织化学染色, ×200）（略）
Figure 2 Expression of P?selectin protein in renal tissue of rats in different groups (Immunohistochemical staining, ×200）
A: Normal control group; B: Untreated group; C: Low?dose VOMBP?treated group; D: Medium?dose VOMBP?treated group; E: High?dose VOMBP?treated group.
3 讨论
炎症机制是近年来在DN发病机制中提出的一种新的观点，越来越多的证据表明在DN患者肾组织内广泛存在炎性细胞的浸润［1］，而黏附分子表达水平的升高在这一环节中又起到了关键作用。目前发现参与DN炎症发病机制的黏附分子主要有选择素家族、免疫球蛋白超家族以及整合素家族3类。其中P?选择素即是选择素家族中的重要成员之一，通常储存于内皮细胞的分泌颗粒（称为Weibel Palade小体）和血小板的α颗粒和致密颗粒中，经刺激后能迅速表达于内皮细胞和活化的血小板表面，可在炎症状态下介导白细胞与内皮细胞及血小板的起始黏附。当P?选择素与白细胞表面的配体结合后，即开始介导白细胞的滚动作用，进而将其锚定在内皮细胞上，之后白细胞从内皮细胞间隙渗出，炎性细胞在肾间质中大量浸润导致炎症损伤。近年来的研究结果已揭示无论在DN患者体内还是在动物模型中，P?选择素表达水平均显著升高，并且还找到了其遗传易感基因及诱导其表达的上游机制［9?11］，因此通过抑制P?选择素的表达而达到抗炎的目的将有可能为寻找DN的治疗途径提供新思路。
肾脏是典型的微血管器官，中医学理论中的络脉与医学的小血管及微循环具有很大的相关性；络病又是以络脉为依托而发生，其病变与血管内皮功能障碍之间关系密切［12］。DN是糖尿病日久产生的微血管并发症，病程长，符合中医“久病入络”的病机观点，并且DN进行性，迁延难愈的临床特点与络脉为病易滞易瘀、易入难出和易积成形的病机特点一致。因此有学者提出以络病机制作为传变的中心环节，探讨DN的发生发展和治疗方法［4, 5］。在诸多通络的中药中，辛味药占了很大的比重，原因在于邪结络中隐曲之处，一般补益活血之药不能入络，而辛味药辛香走窜，能散能行，无处不到，不但可以走窜通络，还可以引其他药物达于络中以发挥作用［13］。故《内经》中说辛可“通气”，《伤寒杂病论》“脏腑经络先后病脉证”篇首开辛温通络用药之先河，清代名医叶天士更是在前人的基础上提出了著名的“久病入络”论断，并创立了辛温通络、辛香通络和辛润通络诸法，倡导辛味药流气畅络的独特作用，“络以辛为泄”、“攻坚垒，佐以辛香，是络病大旨”。
辛夷挥发油是采用现代手段水蒸汽蒸馏法从传统中药辛夷中提取的有效成分。本实验所用辛夷是木兰科植物望春花（望春玉兰）的干燥花蕾，其性味辛温，归肺胃经；具有散风寒和通鼻窍之功，主要用于风寒头痛、鼻塞、鼻渊和鼻流浊涕等外感风寒表证。现代药研究发现辛夷挥发油对于各种急、慢性炎症动物模型均具有可靠的抗炎效应，能明显减轻充血、水肿、坏死和炎性细胞浸润等炎性反应［6］；对嗜酸性粒细胞［7］、中性粒细胞［8］与血管内皮细胞的黏附具有显著的抑制效应；国外有学者已证实，辛夷中提取的木脂素类成分在体外能抑制细胞间黏附分子?1和血管细胞黏附分子?1的表达，可能是其抗炎的分子机制［13］；我们既往研究也发现辛夷挥发油能够抑制肾缺血再灌注大鼠模型血清中细胞间黏附分子?1及P?选择素的表达，减轻肾脏的组织损伤程度，降低BUN和SCr水平，对肾脏有保护作用。辛夷性味辛温，气味芳香，在中医学理论中具有“辛温通络”和“辛香通络”的作用。而且其以花入药，符合《素问·奇病论篇第四十七》中“治之以兰，除陈气也”用花类药治疗消渴病的观点。近年来研究结果也进一步揭示了中药的辛味与挥发油密切关［14］。
本研究结果表明，辛夷挥发油能从蛋白质水平上抑制P?选择素的表达，干预炎症反应，在DN早期（成模后第12周）降低糖尿病大鼠24 h尿微量白蛋白水平，明显减轻肾小球毛细血管基底膜及系膜基质增生情况，对肾脏起到保护作用。同时我们发现，由于在DN的炎症发病机制中存在着肾小球毛细血管内皮的损伤，这与中医学的络病之间存在很大的相关性，从而将其与近年来中医学在DN病机中提出的“络病机制”结合起来，为DN“络病机制”的提出找到了客观的依据，也为中西医结合共同研究DN的发病机制及干预方法找到了关键的结合点。而针对络病机制的治疗中，在中医学“辛药通络”原则的指导下，我们通过实验也证实了性味辛温，气味芳香的辛夷挥发油的确能够干预DN的络病机制，对肾脏起到保护作用，验证了“辛药通络”这一络病证治理论的正确性，为其运用提供了实验依据。另外我们还将辛夷挥发油的通络机制与其能够抑制肾小球毛细血管内皮上P?选择素的表达这一抗炎机制联系起来，推出其通络的机制很可能与其抗炎的机制密切相关的结论。我们还突破了中医学传统理论对辛夷认识及应用的限制，从微观领域和中西医结合的角度探索了辛温解表药辛夷的新的治疗作用及作用机制，发现这种治疗作用与以往中医学从宏观角度对辛夷药效得出的认识并不矛盾，而是从微观领域对其治疗作用作出的新的拓展和尝试。
【】
1 Nauyen D, Ping F, Mu W, et al. Macrophage accumulation in human progressive diabetic nephropathy. Nephrology (Carlton). 2006; 11(3): 226?231.
2 Mou X, Jiang M, Song ML, et al. Experience introduction of Professor Jin?xi Zhao in treating diabetic nephropathy. Xin Zhong Yi. 2005; 37(11): 15?16. Chinese.
牟新, 姜淼, 宋美铃, 等. 赵进喜教授治疗糖尿病肾病经验介绍. 新中医. 2005; 37(11): 15?16.
3 Wang XW, Nan HM. Experience introduction of Professor Zheng Nan in treating diabetic nephropathy. Xin Zhong Yi. 2005; 37(5): 14?15. Chinese.
王雪威, 南红梅. 南征教授治疗糖尿病肾病经验介绍. 新中医. 2005; 37(5): 14?15.
4 Li Y, Zhao Y, Huang QF, et al. Study on mechanism of Luo disease on diabetic nephropathy. Zhongguo Zhong Yi Ji Chu Yi Xue Za Zhi. 2002; 8(3): 68?70. Chinese with abstract in English.
李岩, 赵雁, 黄启福, 等. 糖尿病肾病络病机制研究. 中医基础医学杂志. 2002; 8(3): 68?70.
5 Su BY, Li LW. My opinion on diabetic nephropathy therapy based on network vessel theory. Zhejiang Zhong Yi Za Zhi. 2006; 41(7): 383?384. Chinese.
苏宝印, 李立伟. 运用络病理论治疗糖尿病肾病之我见. 浙江中医杂志. 2006; 41(7): 383?384.
6 Wang WK, Shen YJ, Qi Y, et al. Anti?inflammatory mechanism of the volatile oil of Magnolia biondii Pamp.. Zhongguo Shou Yi Xue Bao. 2005; 25(3): 301?303. Chinese with abstract in English.
王文魁, 沈映君, 齐云, 等. 望春花油的抗炎机理. 中国兽医学报. 2005; 25(3): 301?303.
7 Xiong TQ, Hu P, Qin XH, et al. Effect of biond magnolia flower on adhesion of eosinophile granulocytes. Zhong Yi Za Zhi. 2006; 47(4): 306. Chinese.
熊天琴, 胡鹏, 秦旭华, 等. 辛夷对嗜酸性粒细胞黏附的影响. 中医杂志. 2006; 47(4): 306.
8 Chen ZD, Wang F, Wang NS, et al. Inhibiting effect of volatile oil of biond magnolia flower on adhesion of endotheliocytes and neutrophils. Shannxi Zhong Yi. 2005; 26(10): 1119?1120. Chinese.
陈志东, 王锋, 汪年松, 等. 辛夷挥发油对内皮细胞与中性粒细胞黏附的抑制作用. 陕西中医. 2005; 26(10): 1119?1120.
9 Eschen O, Christensen JH, Schmidt EB. Soluble cellular adhesion molecules in patients with diabetes mellitus: relation to microvascular complications. Endocrinologist. 2006; 16(6): 303?307.
10 Iwamoto M, Mizuiri S, Arita M, et al. Nuclear factor?kappaB activation in diabetic rat kidney: evidence for involvement of P?selectin in diabetic nephropathy. Tohoku J Exp Med. 2005; 206(2): 163?171.
11 Liu Y, Burdon KP, Langefeld CD, et al. P?selectin gene haplotype associations with albuminuria in the Diabetes Heart Study. Kidney Int. 2005; 68(2): 741?746.
12 Wu YL. Study of luo disease. Beijing: Chinese Science and Technology Publishing House. 2004: 98?100, 160. Chinese.
吴以岭. 络病学. 北京: 中国科学技术出版社. 2004: 98?100, 160.
13 Ahn KS, Jung KY, Kim JH, et al. Inhibitory activity of lignan components from the flower buds of Magnoliae fargesii on the expression of cell adhesion molecules. Biol Pharm Bull. 2001; 24(9): 1085?1087.
14 Shen YJ. Study on Chinese diaphoresis relieving superficies medicine. Beijing: Chinese Medicine Technology Publishing House. 2004: 266?279. Chinese.
沈映君. 中药解表方药研究. 北京: 中国医药科技出版社. 2004: 266?279.
