酸枣仁皂苷A对大鼠脑缺血海马区氨基酸递质水平及细胞凋亡的影响

【摘要】  目的：观察酸枣仁皂苷 A对大鼠脑缺血海马区兴奋性氨基酸及细胞凋亡的影响,探讨酸枣仁皂苷 A对脑缺血损伤保护的作用机制。方法：建立大鼠大脑中动脉闭塞再灌注损伤模型,将健康SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注模型组、尼莫地平组、酸枣仁皂苷A组,四组于脑缺血再灌注后12、24、48小时、4天、7天,各取6只大鼠断头取脑，测定大鼠缺血侧脑海马区氨基酸递质水平及细胞凋亡数。结果： 除假手术组外,与模型组比较,尼莫地平组和酸枣仁皂苷 A组各观察时间点缺血侧脑海马区谷氨酸(Glu)及细胞凋亡均明显降低(P<0.05) ，而γ?氨基丁酸(GABA)在各时间点均明显升高;与尼莫地平组比较,酸枣仁皂苷 A组大鼠缺血侧海马区Glu降低(P<0.05)，酸枣仁皂苷 A组细胞凋亡数降低更显著(P<0.05)，两组GABA比较，差异无显著性意义(P>0.05)。结论：酸枣仁皂苷 A能调节脑缺血损伤后海马区氨基酸水平的释放，抑制细胞凋亡。

【关键词】  脑缺血 兴奋性氨基酸 细胞凋亡 酸枣仁皂苷A

　　Abstract Objective:To observe the effect of jujuboside A (JuA) on amino acids levels and apoptosis in hippocampus cerebral ischemia in rats and to probe into the neuro-protection mechanism of mild hypothermia on cerebral ischemic injury. Methods:Using the model of focal middle cerebral artery occluded, the healthy Wistar rats were randomly divided into sham group, cerebral ischemia model group, nimodipine group, and JuA treatment group. Every 6 rats in each group were sacrificed on 0.5d, 1d, 2d, 4d, and 7d after cerebral ischemia and reperfusion to determine amino acids and apoptosis levels in the brain. Results:Compared with the model group, the nimodipine and JuA groups had glutamic acid and apoptosis significantly decreased (P<0.05) and Gamma aminobutyric acid(GABA) increased at each time point except the Sham group. Compared with the nimodipine group, the level of glutamic acid and apoptosis reduced more significantly in the JuA group(P<0.05),but the difference in GABA was not significant between the 2 groups(P>0.05).Conclusion:JuA can regulate effectively the release of amino acid and decrease apoptosis in the hippocampus after cerebral ischemic injury.

　　Key words jujuboside A cerebral ischemia amino acids apoptosis

　　酸枣仁主要用于镇静安神。近年来发现其主要成分酸枣仁皂苷 A对缺血后脑损伤有神经保护作用，但其具体机制目前尚不完全清楚。本实验采用大鼠局灶性脑缺血模型，观察脑缺血损伤海马区氨基酸递质水平变化及神经元细胞凋亡的变化及酸枣仁皂苷 A对两类指标的影响，旨在从细胞和分子水平进一步探讨酸枣仁皂苷 A的可能作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 雄性SD大鼠120只，体重200～230g，由广西药品检验所实验动物中心提供。

　　1.2 模型制备及分组 手术组采用稍加改良的Zea?Longa 法，将SD大鼠制备为大脑中动脉闭塞再灌注损伤模型(MCAO ) ,操作方法：取SD大鼠，用10%水合氯醛腹腔麻醉(35mg/100g)，仰卧固定在手术台上，颈部备皮，常规消毒铺巾。行颈部正中切口，逐层分离并暴露右侧颈总动脉(arteria carotis commun,CCA )，小心分离右侧CCA、颈内动脉( arteria carotis interna,ICA ) 及颈外动脉(arteria carotis externa,ECA )，避免刺激迷走神经。在CCA、ICA、ECA 上各置一根3?0 丝线，于ECA分出甲状腺上动脉和枕动脉后的远端(约距颈总动脉分叉处5mm ～ 7mm)，结扎ECA。随后于ICA和CCA处分别置显微动脉夹，在距ICA、ECA分叉3mm 的CCA 上剪一“V ”形切口。将尼龙线烤钝的一端插入CCA 上的小口，放松ICA 上预置的动脉夹，将尼龙线由CCA 插入ICA 内，向前徐进18～20mm，稍遇阻力即停止进入。将预置在ICA 上的丝线扎紧，防止出血和栓子滑出。缝合皮肤，术毕。随机分为缺血再灌注模型组、尼莫地平组、酸枣仁皂苷A组，假手术组按上述方法麻醉后，切开皮肤后即缝合。

　　1.3 给药方法 酸枣仁皂苷A组给予酸枣仁皂苷A[成都天福堂有限责任公司提供(纯度≥98%)]20mg/kg，尼莫地平组给予尼莫地平注射液1mg/kg，假手术组及模型组给予等体积生理盐水，均作腹腔注射。各组于术前30min给药1次，术后仍按上述剂量给药，1天1次。四组于缺血后12、24、48小时、4天、7天 ，各取6只大鼠断头取脑测定各项指标。

　　1.4 检测指标及方法

　　1.4.1 氨基酸含量 实验结束时迅速断头取脑，于冰盘上分离出右侧额顶叶大脑皮质，制备脑组织，称湿重，匀浆，离心沉淀后取上清液用 HPLC荧光法检测谷氨酸(Glu)、γ?氨基丁酸(GABA)含量。

　　1.4.2 神经细胞凋亡 大鼠断头后,立即取出部分右侧脑组织置于中性甲醛(pH7.2～7.4的磷酸缓冲液PBS为溶剂的甲醛)中常温固定12小时，自丘脑中1/3 平面行冠状切片，厚约4mm,依次脱水、浸蜡、包埋，切片厚度约6μm，HE染色，光镜下观察确定海马位置，临近处的石蜡标本连续切片。切片放入65℃的烤片机上6小时，取出后放入4℃冰箱待用。采用原位缺口末端标记( TUNEL )法检测细胞凋亡：将组织切片依次脱蜡，进行TUNEL 染色，观察400倍光镜5个视野下平均阳性细胞数，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

　　1.5 统计学方法 实验数据以(±s)表示,用SPSS 11.0统计软件进行数据处理，应用单因素方差分析，组间两两比较用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 谷氨酸释放情况 假手术组各时点无明显变化。与模型组比较，尼莫地平组各时点谷氨酸释放均减少，其中24、48小时差异有统计学意义(P<0.05);酸枣仁皂苷 A组与模型组比较，5个观察时间点谷氨酸释放均明显降低，4天差异有统计学意义(P<0.05);酸枣仁皂苷A组与尼莫地平组比较，12、24、48小时谷氨酸释放较尼莫地平组高,但差异无统计学意义(P>0.01);4天、7天谷氨酸释放较尼莫地平组降低，差异无统计学意义(P>0.05)。谷氨酸释放时点分布：12小时开始增高，48小时为高峰后呈下降趋势，以第7天下降最明显，见表1。表1 四组谷氨酸释放量比较与模型组比较，△P<0.05

　　2.2 γ?氨基丁酸释放情况 与模型组比较，尼莫地平组各时点GABA释放均升高，其中48小时、4天差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，酸枣仁皂苷A组5个观察时间点GABA释放均较模型组明显升高，其中第4天差异有统计学意义(P<0.05)。与尼莫地平组比较，酸枣仁皂苷A组12、24、48小时谷氨酸释放较尼莫地平组低，差异无统计学意义(P>0.05)。GABA释放时点分布：12小时开始增高，4天为高峰，后呈下降趋势，第7天下降最明显，见表2。

　　2.3 神经细胞凋亡情况 假手术组在各个时间点脑组织切片未见阳性细胞;与模型组比较，尼莫地平组12、24小时阳性细胞明显降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，48小时、4天差异有统计学意义(P<0.05)，7天较模型组有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。酸枣仁皂苷 A组与模型组比较，12、24小时阳性细胞降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，48小时、4天、7天差异有统计学意义(P<0.05)。与尼莫地平比较，酸枣仁皂苷A组12、14、48小时阳性细胞增高,但差异无统计学意义(P>0.05);4天阳性细胞降低,但差异无统计学意义;7天差异有显著性意义(P<0.05)。凋亡细胞时点分布：12小时开始增高，24小时为高峰，后呈下降趋势，第7天下降最明显，见表3。表2 四组γ-氨基丁酸释放量比较与模型组比较，△P<0.05表3 四组神经细胞凋亡计数比较与模型组比较，△P<0.05;与尼莫地平组比较，▲P<0.05

　　3 讨 论

　　脑缺血可以诱发一系列的损伤机制，其中兴奋性氨基酸(excitatory amino acid,EAA )过度释放，作用于突触后膜受体，使EAA受体敏感性增高，引起突触后神经元过度兴奋、溃变、坏死。当脑缺血缺氧时,EAA迅速升高,其中谷氨酸(Glutamate,Glu)是脑内最重要的EAA[1]。研究表明，抑制缺血缺氧时脑内EAA的增高，对减轻和延缓缺血神经元损伤、保护缺血脑组织有重要作用[2～5]。本研究选择尼莫地平做阳性对照，其通过调节氨基酸递质水平的神经保护作用已被肯定[6]。研究还发现，EAA升高的同时也会出现抑制性氨基酸(inhibitory amino acid,IAA)的释放增加[7]，这一过程可以对抗 EAA 的过量释放而发挥保护作用，其中 GABA参与这一抑制性作用。

　　本实验大鼠脑缺血后采用酸枣仁皂苷 A干预可增强缺血脑组织 GABA 的表达，其神经保护作用与增强 GABA 表达、抑制兴奋毒性有关。脑缺血后，神经细胞凋亡的发生既是凋亡相关基因表达的结果，又受许多内外因素的调节，主要有兴奋性氨基酸、氧自由基、神经元生存环境变化和凋亡基因的调控等因素对脑缺血细胞凋亡过程的调节。谷氨酸等氨基酸的兴奋毒性作用和自由基的毒性作用在急性脑缺血细胞死亡、再灌注损伤和迟发性神经元死亡中起重要作用。脑缺血时，GABA与Glu 同步增高，损伤进展时，GABA降低,加重缺血性脑损伤。另外，谷氨酸受体介导的兴奋毒性作用也可通过凋亡机制实现。本实验结果显示，酸枣仁皂苷 A处理后的大鼠在脑缺血后，细胞凋亡密度较模型组及尼莫地平治疗组明显降低，说明经酸枣仁皂苷A处理可以抑制脑缺血后海马区的细胞凋亡。

【】
  　　1 Kaur J,Zhao Z,Geransar RM,et al.Prior deafferentation confers long term protection to CA1 against transient forebrain ischemia and sustains GluR2 expression.Brain Res,2006,1075(1):201?212

　　2 Ooboshi H,Ibayashi S,Takano K,et al.Hypothermia inhibits ischemia-induced efflux of amino acids and neuronal damage in the hippocampus of aged rats.Brain Res，2000,884(1?2):23?30

　　3 Maier CM,Sun GH,Kunis D,et al.Delayed induction and long-term effects of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia: neurological outcome and infarct size.J Neurosurg，2001,94(1):90?96

　　4 Dong H,Moody?Corbett F,Colbourne F,et al.Electrophysiological properties of CA1 neurons protected by postischemic hypothermia in gerbils.Stroke,2001,32(3):788?795

　　5 Fujisawa H,Koizumi H,Ito H,et al.Effects of mild hypothermia on the cortical release of excitatory amino acids and nitric oxide synthesis following hypoxia.J Neurotrauma,1999,16(11):1083?1093

　　7 Grondahl TO,Berg?Johnsen J,Langmoen IA.Chloride influx during cerebral energy deprivation.Neurol Res,1998,20(2):131?136