白藜芦醇体外及小鼠体内抗白血病作用机制
【摘要】 目的：探讨白藜芦醇（resveratrol, Res）体内外抗白血病作用的分子机制。
方法：采用HuT?78、Jurkat和L1210 3种白血病细胞株，不同浓度Res作用不同时间后，应用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）比色法检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞凋亡，蛋白印迹法检测Bcl?2和Bax蛋白表达，免疫沉淀法检测信号转导子和转录激活子（signal transducers and activators of transcription，STAT）3及其磷酸化活性（phospho?Tyr705?STAT3, p?STAT3）。BALB/c小鼠随机分为模型组和12.5、25、50 mg/(kg·d) Res组，皮下注射L1210细胞建立白血病模型。逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription?polymerase chain reaction, RT?PCR）检测各组白血病小鼠外周血T淋巴细胞白细胞介素6（interleukin?6, IL?6）基因表达，流式细胞仪检测IL?6蛋白分泌，免疫组织化学法和蛋白印迹法检测肝脏活性p?STAT3蛋白表达。
结果：Res能抑制白血病细胞HuT?78、Jurkat、L1210的生长增殖，诱导细胞凋亡，同时明显下调Bcl?2/Bax比值、降低活性p?STAT3的蛋白表达；Res还能够剂量依赖地下调白血病小鼠外周血T淋巴细胞IL?6 mRNA表达及其胞内分泌，同时降低小鼠肝组织中活性p?STAT3蛋白表达水平。
结论：Res体内外均具有明显的抗白血病效应，其作用机制可能与其对IL?6及p?STAT3的影响有关。
【关键词】 白藜芦醇; 细胞凋亡; 白血病; 白细胞介素6; STAT3转录因子; 信号转导接头蛋白类; 小鼠; 体外研究
Methods: Three kinds of leukemia cell lines, HuT?78, Jurkat and L1210 cells, were used in this study. After different doses of Res treatment, methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetry was used to detect the cell proliferation; apoptosis was detected by flow cytometry; Western blot and immuno?precipitation method were used to detect the Bcl?2 and Bax proteins expression and the activity of phospho?signal transducer and activator of transcription 3 (p?STAT3). Besides, a total of 40 BALB/c mice were randomly divided into untreated group and 12.5, 25 and 50 mg/(kg·d) Res groups. Then, leukemia?bearing model was established by L1210 cells subcutaneous injection. Interleukin?6 (IL?6) was detected to determine the secretion function of T lymphocytes of the mice; the IL?6 mRNA expression in the liver tissue of mice was also detected by reverse transcription?polymerase chain reaction (RT?PCR), and the expression of the p?STAT3 protein was measured by Western blot and immunohistochemical method.
Results: The results indicated that resveratrol could inhibit the proliferation of HuT?78, Jurkat and L1210 cells and significantly induce the cell apoptosis. At the same time, the radio of Bcl?2/Bax and expression of p?STAT3 protein were decreased either. Furthermore, resveratrol could reduce the expression of IL?6 mRNA and intracellular content of IL?6, and decrease the expression of p?STAT3 protein in the liver of leukemic mice at a dose?dependent manner.
Conclusion: Resveratrol can function as an antileukemic agent through inducing apoptosis, modulating IL?6 and STAT3 both in vitro and in vivo.
Keywords: resveratrol; apoptosis; leukemia; interleukin?6; STAT3 transcription factor; signal transducing adaptor proteins; mice; in vitro study
白藜芦醇（resveratrol, Res）化学名称芪三酚，结构为3,5,4'?三羟基二苯乙烯，分子式为C14H12O3。含有Res的常见中药材有决明、藜芦和虎杖等，食物有葡萄和花生等。Jang等［1］对Res在肿瘤发生、各阶段的抑制作用进行了系统的报道，从而使Res成为肿瘤预防和领域的一个研究热点。虽然Res的抗肿瘤作用已在诸多细胞系中得到证实［2, 3］，但其具体应用在不同的研究中存在较大差异，而且现有的研究多局限于功能水平。因此，阐明Res抗肿瘤作用的具体分子机制，是对其开发利用及理论研究的重要前提之一。本课题以3种不同来源的白血病细胞株及白血病腹水瘤小鼠作为研究对象，选用Res为干预药物，采用体外细胞培养与整体动物实验相结合的方法，以探讨Res的抗白血病作用及其可能的分子机制。
1 材料和方法
1.1 主要材料 Res（纯度98.36％，由陕西地区生产的虎杖中提取），购于陕西赛德生物股份有限公司；Bcl?2和Bax抗体，购于Labvision公司；CD3?藻红蛋白（phycoerythrin，PE）?Cy5、CD4?异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）、CD8?PE和IL?6?PE，购于Ebioscience公司；信号转导子和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）多克隆抗体及其磷酸化（phospho?Tyr705?STAT3, p?STAT3）抗体，购于Santa Cruz公司；链霉卵白素（histostain?streptavidin?peroxidase, SP）免疫组化染色试剂盒，购于北京中杉金桥生物有限公司。小鼠淋巴细胞白血病细胞株L1210，由西安大学生命学院王一理老师惠赠；人皮肤T细胞淋巴瘤细胞株HuT?78和人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat，由西安交通大学医学院第一附属陈颖老师惠赠。BALB/c小鼠，6周龄，雄性，体质量（20±2）g，西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物合格证号为SYXK（陕）2007?003。
1.2 药物处理及细胞增殖分析 Res溶于二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide, DMSO）成1 g/L，滤过除菌，－20 ℃贮存。用时以RPMI 1640细胞培养基稀释至所需浓度，使DMSO终浓度不高于0.1%，此时对细胞生长活性无影响。台盼蓝染色法活细胞计数≥95%，调整细胞浓度为5 000个/ml，以6.25、12.5、25、50、100和200 μmol/L Res分别培养HuT?78、Jurkat和L1210细胞12、24和48 h。加入5 mg/ml甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），终浓度0.2 mg/ml，再培养4 h，弃上清，加入DMSO溶解沉淀，570 nm处测定吸光度（absorbance, A）值，计数细胞生长抑制率及半数抑制浓度（inhibiting concentration 50%, IC50）。
1.3 Annexin?V法检测细胞凋亡 调细胞终浓度为1×105个/ml，用100 μmol/L Res培养HuT?78、Jurkat和L1210细胞12、24和48 h，空白对照组加等体积RPMI 1640培养基。FITC标记的Annexin?V和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色后，通过流式细胞仪(FACScan型，美国BD公司)定量检测各组细胞凋亡情况。
1.4 蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl?2、Bax的相对表达 以IC50Res培养各组白血病细胞24 h，蛋白印迹法分析Res对凋亡相关蛋白Bcl?2和Bax的影响。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS?PAGE），半干法转膜1.5 h，加入相应一抗（1︰200稀释）及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的二抗（1︰5 000稀释），增强化学发光（enhanced chemiluminescence, ECL）法检测，最后进行图片扫描和分析，采用Quantity One软件进行数据处理，以β?actin蛋白为内参照进行半定量分析。
1.5 免疫沉淀法检测活性p?STAT3蛋白表达 0.5%血清饥饿12 h，以25、50和100 μmol/L Res培养HuT?78、Jurkat和L1210细胞24 h，并设空白对照组。提取细胞蛋白，以充分重悬的蛋白G琼脂糖（protein G agarose）进行沉淀，BCA法测定蛋白浓度，分别取各组细胞50 μg总蛋白进行SDS?PAGE电泳，p?STAT3稀释倍数为1︰1 000，以非磷酸化抗体作内标。
1.6 动物给药及模型建立 参见方法［4］，40只BALB/c小鼠随机分为L1210对照组和L1210+12.5、25、50 mg/(kg·d) Res组，每组10只，药物干预组小鼠连续灌服Res 3周。给药5 d后，腹腔接种L1210 （1～5）×107个/ml细胞一次，0.2 ml/只。肿瘤接种后继续灌胃治疗16 d，并于接种后第3天起，每天眼眶静脉丛采血进行外周血白细胞计数及血涂片瑞?吉氏染色，找到白血病细胞证实小鼠白血病模型建立成功。
1.7 逆转录酶聚合酶链式反应法检测小鼠T淋巴细胞白细胞介素6 mRNA表达 治疗结束后，收集各组小鼠外周血T淋巴细胞，逆转录聚合酶链式反应法（reverse transcription?polymerase chain reaction, RT?PCR）检测小鼠白细胞介素6（interleukin?6, IL?6） mRNA表达，按试剂盒说明操作。采用异硫氰酸胍一步法提取RNA，分光光度计测A260/A280比值在1.8～2.0之间。IL?6和β?actin引物序列由北京奥科生物技术有限责任公司提供。IL?6上游引物5'?CTG GTG ACA ACC ACG GCC TTC CCT A?3'；下游引物5'?ATG CTT AGG CAT AAC GCA CTA GGT T?3'；扩增片段长度为600 bp。β?actin上游引物5'?ACC TCT ATG CCA ACA CAG?3'；下游引物5'?GTA ACA GTC CGC CTA GAA G?3'；扩增片断长度为266 bp。采用Promega公司的逆转录试剂盒，按说明书进行cDNA的合成。PCR扩增条件为25 μl PCR反应体系，包括10×PCR buffer 2.5 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，上下游引物各1 μl，Taq酶 2.5 U，cDNA 10 μl。预变性94 ℃ 3 min后，93 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30个循环，循环结束后72 ℃ 5 min。取扩增产物5 μl在1.0%琼脂糖凝胶中电泳（150 V恒压电泳0.5 h），应用Gel?Doc2000型全自动凝胶成像分析仪照相并测定每条带的光密度值，以β?actin的表达量为内参照，并比较各组样本目标片段的相对表达量。
1.8 流式细胞术检测小鼠T淋巴细胞内IL?6分泌 治疗结束后，收集各组小鼠外周血T淋巴细胞，加入12?十四酸佛波酯13?乙酸盐（phorbol 12?myristate 13?acetate，PMA）（使其终浓度为25 ng/ml）和布雷菲德菌素A（brefeldin A，BFA）（终浓度为10 ng/ml），混匀，37 ℃、5% CO2培养4～6 h，将10 μl CD4?FITC、10 μl IL?6?PE、100 μl激活后的T淋巴细胞（2×106/ml）混匀，孵育1 min。加入溶血素，室温暗处孵育10 min，固定，破膜，加入IL?6?PE（0.5 μg/106细胞）孵育30 min，流式细胞仪分析胞内IL?6的分泌情况。
1.9 免疫组化法检测小鼠肝脏活性p?STAT3蛋白表达 取各组小鼠肝脏，后固定1 d，20％、30％蔗糖梯度脱水，冰冻切片（8 μm），其余步骤依据试剂盒说明操作。以胞浆或胞核出现棕黄色连续或灶性颗粒状分布为阳性表达。半定量分析活性p?STAT3蛋白的阳性表达率。
1.10 蛋白印迹法检测小鼠肝脏活性p?STAT3蛋白表达 按照试剂盒说明方法提取小鼠肝脏组织细胞核蛋白，蛋白印迹法操作步骤同前。p?STAT3一抗1︰500稀释，HRP标记的二抗1︰5 000稀释，以非磷酸化抗体作内标参考。
1.11 统计学方法 计量资料数据以x±s表示，所有数据均用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，采用多因素重复测量数据的方差分析或单因素方差分析进行组间比较。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 Res对白血病细胞的生长抑制作用 不同浓度Res作用12、24、48 h，其对白血病细胞的增殖抑制作用呈一定的时间?剂量依赖性。Res对白血病细胞的增殖抑制最高生长抑制率约为82.66％（HuT?78）、63.95％（Jurkat）以及70.69%（L1210）。Res作用HuT?78、Jurkat、L1210细胞24 h的IC50分别为106.38、172.12和99.66 μmol/L。见表1。
2.2 Res诱导白血病细胞凋亡 100 μmol/L Res能以时间依赖性的方式诱导白血病细胞凋亡，同样条件下，Res对HuT?78细胞与L1210细胞的促凋亡作用强于Jurkat细胞。流式细胞术分析可见，100 μmol/L Res作用48 h时，（84.33±2.14）％的HuT?78细胞发生了凋亡，Jurkat细胞和L1210细胞的凋亡率分别为（41.99±1.73）％和（50.94±2.56）％。见图1和图2。
2.3 Res影响白血病细胞凋亡相关蛋白Bcl?2和Bax的表达 以各组细胞的IC50Res培养24 h，β?actin作内标参考，蛋白印迹结果显示，Res下调HuT?78、Jurkat与L1210细胞Bcl?2蛋白的表达水平，明显增加Bax蛋白表达，Bcl?2/Bax值显著降低，与相应空白对照相比，差异有统计学意义（P<0.01）。见图3。
表1 白藜芦醇对白血病细胞HuT?78、Jurkat及 L1210的生长抑制作用（略）
Table 1 Growth inhibition of resveratrol to leukemia cells HuT?78, Jurkat and L1210 in vitro
**P<0.01, vs 6.25 μmol/L Res; △P<0.05, △△P<0.01, vs after 12?hour Res treatment.
图1 流式细胞仪检测100 μmol/L白藜芦醇干预24 h后对白血病细胞凋亡的影响（略）
Figure 1 Effects of 100 μmol/L Res on apoptosis of leukemia cells after 24?hour treatment in vitro detected by flow cytometry
The apoptotic and necrotic cell distribution is analyzed by Annexin V binding and PI uptake. Positioning of quadrants on Annexin V/PI dot plots is performed, and living cells (Annexin V-/PI-), early apoptotic/primary apoptotic cells (Annexin V+/PI-), late apoptotic/secondary apoptotic cells (Annexin V+/PI+) and necrotic cells (Annexin V-/PI+) are distinguished. Therefore, the total apoptotic proportion includes the percentage of cells with fluorescence Annexin V+/PI- and Annexin V+/PI+. A, C, E: HuT?78, Jurkat and L1210 cells treated with 100 μmol/L resveratrol; B, D, F: Control of HuT?78, Jurkat and L1210 cells.
图2 流式细胞仪检测100 μmol/L白藜芦醇干预不同时间后对白血病细胞凋亡的影响（略）
Figure 2 Effects of 100 μmol/L Res on apoptosis of leukemia cells after 12?, 24?, 48?hour treatment in vitro detected by flow cytometry
**P<0.01, vs Jurkat cells; △△P<0.01, vs L1210 cells. n=3.
图3 蛋白印迹法检测白藜芦醇干预24 h后对白血病细胞Bcl?2和Bax蛋白表达的影响（略）
Figure 3 Effects of Res on expressions of Bcl?2 and Bax proteins in leukemia cells after 24?hour treatment in vitro detected by Western blotting
1: HuT?78 control group; 2: Jurkat control group; 3: L1210 control group; 4: HuT?78 IC50 Res group; 5: Jurkat IC50 Res group; 6: L1210 IC50 Res group.
2.4 Res对白血病细胞活性p?STAT3蛋白表达的影响 不同浓度Res处理各组白血病细胞24 h后，经反复检测，Res作用前，在分子量89 kD处可见一较深的STAT3酪氨酸磷酸化蛋白带，与对照相比，Res以剂量依赖的方式减弱HuT?78与L1210细胞STAT3的酪氨酸磷酸化表达；而对于Jurkat细胞，只有100 μmol/L Res可见p?STAT3水平下调，余者变化不明显。各组STAT3非磷酸化蛋白的表达水平无明显变化。见图4。
2.5 Res调控白血病细胞IL?6的表达与分泌 Res剂量依赖性地下调白血病小鼠T淋巴细胞IL?6 mRNA表达。此外，通过流式细胞术对胞内IL?6水平的检测可见，Res能以剂量依赖的方式降低白血病小鼠T淋巴细胞内IL?6的分泌水平。见图5和图6。
2.6 Res下调白血病小鼠活性p?STAT3蛋白的表达 各组小鼠解剖后可见白血病小鼠肝脏明显肿大。免疫组化结果显示，p?STAT3呈强阳性表达，Res组肝组织中p?STAT3蛋白表达均下调。模型组阳性率为（86.55±5.26）％，12.5 mg/(kg·d) Res组阳性率为（78.3±3.32）％，与模型组比较差异无统计学意义；25、50 mg/(kg·d) Res组阳性率分别为（43.5±2.55）％和（23.5±3.31）％，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。见图7。
蛋白印迹法结果显示，灌服不同剂量Res后，荷瘤小鼠肝组织中活性p?STAT3蛋白表达呈剂量依赖性下调，同时，非磷酸化STAT3蛋白表达无显著变化。见图8。
图4 免疫沉淀法检测白藜芦醇干预24 h后对白血病细胞活性p?STAT3和STAT3蛋白表达的影响（略）
Figure 4 Effects of Res on expressions of p?STAT3 and STAT3 proteins in leukemia cells after 24?hour treatment in vitro detected by immuno?precipitation method
1: Blank control group; 2: 25 μmol/L Res group; 3: 50 μmol/L Res group; 4: 100 μmol/L Res group.
图5 RT?PCR检测白藜芦醇对小鼠T淋巴细胞IL?6 mRNA表达的影响（略）
Figure 5 Effects of Res on the expression of IL?6 mRNA in T lymphocytes in mice detected by RT?PCR
1: Blank control group; 2: 12.5 mg/(kg·d) Res group; 3: 25 mg/(kg·d) Res group; 4: 50 mg/(kg·d) Res group.
图6 流式细胞术检测白藜芦醇对小鼠T淋巴细胞内IL?6含量的影响（略）
Figure 6 Content of IL?6 in T lymphocytes in mice detected by flow cytometry Positioning of quadrants on FITC/PE dot plots was performed and intracellular IL?6 (FITC＋/PE＋) were determined.
A: Blank control group; B: 12.5 mg/(kg·d) Res group; C: 25 mg/(kg·d) Res group; D: 50 mg/(kg·d) Res group. *P<0.05, **P<0.01, vs blank control group. n=3.
图7 免疫组化法检测白藜芦醇对小鼠肝脏中活性p?STAT3表达的影响(光学显微镜，×400)（略）
Figure 7 Effects of Res on expression of p?STAT3 protein in liver tissue in mice detected by immunohistochemistry
(Light microscopy, ×400)
A: Blank control group; B: 12.5 mg/(kg·d) Res group; C: 25 mg/(kg·d) Res group; D: 50 mg/(kg·d) Res group.
图8 蛋白印迹法检测白藜芦醇对小鼠肝脏中活性p?STAT3表达的影响（略）
Figure 8 Effects of Res on expression of p?STAT3 protein in liver tissue in mice detected by Western blotting
1: Blank control group; 2: 12.5 mg/(kg·d) Res group; 3: 25 mg/(kg·d) Res group; 4: 50 mg/(kg·d) Res group.
3 讨论
白血病的常规疗法主要是放疗和化疗，但是由于缺乏选择特异性，往往对正常组织、器官（特别是骨髓和消化道）造成功能性或器质性的损伤。有研究显示，Res对造血系统毒性小［5］，提示它在白血病的中具有潜在的应用价值。本研究通过对3种淋巴系白血病细胞的研究发现，Res具有良好的增殖抑制和诱导凋亡作用。
Bcl?2基因是血液系统恶性肿瘤最为重要的抗凋亡基因，Bax基因能够与Bcl?2组成同源或异源二聚体，通过抑制Bcl?2而发挥促进细胞凋亡的作用。现有研究已证实，Bax表达增加和（或）Bcl?2表达抑制均可导致线粒体膜渗透性转换，引起线粒体细胞色素C释放，进而诱发Caspase激活以致细胞凋亡［6］。本研究显示，Res能不同程度地减少白血病细胞抗凋亡蛋白Bcl?2表达，增加Bax蛋白表达，使Bcl?2/Bax比值降低，提示这可能是其诱导白血病细胞凋亡的分子机制之一。但是，白血病细胞凋亡是一个多基因相互作用的复杂事件，这一过程可能还涉及其他的调控基因和信号途径。因此，本研究继续探讨了Res对IL?6及信号转导分子的调控作用。
研究显示，炎症往往导致细胞恶性转化或者是致癌过程的起始阶段，肿瘤细胞能持续产生大量IL?6，急性淋巴细胞白血病和急性非淋巴细胞白血病患者血清IL?6含量明显高于正常水平，IL?6可能通过自分泌机制与白血病的发病相关［7, 8］。这些发现使IL?6与白血病的关系日益受到人们关注。Takada等［9］比较了几种非甾体抗炎药物，发现Res是其中最强的抗炎和抗增殖物质。本研究中，白血病小鼠T淋巴细胞内IL?6水平显著增高，提示其在白血病的病理进程中的确具有重要作用。Res干预后小鼠IL?6 mRNA的基因表达明显下调，不过，仅仅从mRNA水平检测IL?6的变化还不能揭示Res对IL?6蛋白水平的影响。因此，本文进一步采用胞内细胞因子染色的方法检测胞内IL?6的分泌。PMA能够刺激T细胞产生IL?6，BFA则通过阻断胞内高尔基复合体介导的转运，使IL?6聚集在胞内，再通过标记的CD4+分析特异性T细胞分泌IL?6的情况。本研究发现，Res对胞内IL?6的释放具有较明显的抑制作用。目前已经明确两条信号通路——激活蛋白(activator protein, AP)和蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）通路参与IL?6的基因表达与调控，Res的作用是否与这两条通路有关及其调控IL?6的具体分子机制尚需进一步研究阐明。
STAT信号通路是IL?6介导的信号转导途径之一。正常情况下STAT的激活是一过性的，但是白血病细胞中存在STAT的持续性激活，其中活化的主要是STAT1和STAT3。当STAT3被磷酸化激活后形成二聚体并转入核内，通过与DNA作用元件结合，激活与生长增殖有关的基因转录或者增加抗凋亡蛋白（如Bcl?2）的表达，最终引起癌变［10］。本研究中，Res剂量依赖地下调白血病细胞p?STAT3和Bcl?2表达，提示其可能是通过阻断STAT3信号转导通路，使靶基因Bcl?2表达受阻，进而诱导细胞凋亡，发挥抗白血病效应。此外，本研究还检测了白血病小鼠肝组织中p?STAT3的水平。Res使STAT3的酪氨酸磷酸化活性表达降低、STAT3信号的组成性激活明显减弱。Wung等［11］也证实Res能通过减弱STAT3磷酸化抑制IL?6诱导的细胞间黏附分子?1（intracellular adhesion molecule?1, ICAM?1）基因表达，与我们的研究结果一致。
本文通过体外细胞培养和动物实验，较为全面、深入地探讨了Res抗白血病、调控IL?6及其信号通路的作用。虽然Res体内外均具有较好的抗白血病效应，并且与IL?6及STAT3信号通路存在较为密切的相关性，但是由于不同信号转导通路间存在交叉，除了IL?6外尚有多种细胞因子参与STAT3信号通路，Res是否还影响其他信号分子与转导通路尚不清楚，而且Res对白血病细胞的作用具有高变性，不同细胞对其敏感性各不相同，这些问题都有待于进一步研究阐明。揭示Res发挥作用的具体分子机制，也许能为新的白血病治疗策略提供更多启示。
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