补骨脂素加长波紫外线光化学疗法对K562细胞凋亡及线粒体膜电位的影响

                    作者：黄世林, 陈楠楠, 向阳, 张晨, 张励, 张德杰 

【摘要】  　　目的：研究补骨脂素（psoralen, PSO）加长波紫外线（ultraviolet?A, UVA）光化学疗法（PUVA）对人白血病细胞K562凋亡及线粒体膜电位的影响。

　　方法：K562细胞与不同浓度PSO，接受或不接受UVA照射后共同培养，透射显微镜下观察细胞超微结构改变，流式细胞仪检测细胞凋亡率和线粒体膜电位变化，采用多因素方差分析法进行统计学处理。

　　结果：PUVA处理后的K562细胞超微结构出现明显的凋亡形态学改变。PSO、UVA照射及PUVA均可使细胞凋亡率增加，线粒体膜电位下降；PUVA的作用显著强于前两者（P<0.01）。

　　结论：PUVA可诱导白血病K562细胞发生凋亡，诱导凋亡途径之一为下调线粒体膜电位水平。

【关键词】  补骨脂素; 光化学疗法; 白血病; K562细胞; 细胞凋亡; 线粒体膜电位

　　Methods: K562 cells were incubated with PSO in different concentrations (10, 20, 40 and 80 μg/ml for 24 hours) and irradiated without or with UVA (5 min). The changes in ultrastructure of the cells were observed under a transmission electron microscope. The apoptosis rates and the changes of mitochondrial membrane potentials were detected by flow cytometry. The factorial design and analysis of variance were used to analyze the interaction among the factors.

　　Results: There were obvious ultrastructure changes related to apoptosis in K562 cells after being treated with PUVA (80 μg/ml). PSO, UVA and PUVA all increased the apoptosis rates and decreased the mitochondrial membrane potentials, and the effects of PUVA were stronger than those of PSO and UVA (P<0.01).

　　Conclusion: PUVA can induce the apoptosis of K562 cells and one of the pathways to the induction of apoptosis is to down?regulate the mitochondrial membrane potentials.

　　Keywords: psoralen; photochemotherapy; leukemia; K562 cells; apoptosis; mitochondrial membrane potential
   
　　补骨脂素（psoralen, PSO）是中药补骨脂(Psoralea corylifolia L.)种子中的主要成分，又称呋喃香豆素。PSO加长波紫外线（ultraviolet?A, UVA）的光化学疗法（简称PUVA）对人白血病细胞HL?60、K562、NB4均有一定的杀伤作用［1］，但其作用机制尚不清楚，本实验拟探讨PUVA对K562细胞凋亡的作用及部分作用机制，为PUVA的临床应用提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  细胞株  人红白血病K562细胞株，由大连医科大学人体解剖与组织胚胎学教研室惠赠。

　　1.2  药品及主要试剂  PSO注射剂，46%乙醇溶解为5 mg/ml，大连理工大学及人民解放军第210合作从中药补骨脂中提取和制备；二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide, DMSO），购自北京化工厂；RPMI 1640培养液购自Gibco公司；小牛血清，购自杭州四季青生物材料工程公司；JC?1试剂盒，为Molecular Probe公司产品。

　　1.3  仪器和设备  EPICS XL型流式细胞仪，购自美国Beckman Coulter公司；GLY?10型光量子血液平衡仪，购自徐州华卫医疗设备公司。

　　1.4  细胞培养  K562细胞常规培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基（含硫酸庆大霉素0.025 U/ml）中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中进行连续培养。

　　1.5  实验分组  依据是否采用UVA照射和PSO浓度不同，将实验组分为K562细胞对照组、UVA照射组、PSO各浓度（10、20、40、80 μg/ml）组及PUVA各浓度（10、20、40、80 μg/ml）组，其中UVA照射时间为5 min。

　　1.6  透射电子显微镜下观察K562细胞超微结构  收集浓度为5.0×105/ml，经80 μg/ml PUVA处理的K562细胞10 ml，用PBS清洗两次，转入10 ml离心管，离心（2 000 r/min）3 min，弃上清，缓缓加入2.5%戊二醛2 ml，4 ℃冰箱静置2 h以上。磷酸缓冲液冲洗，锇酸固定，经水洗、脱水、浸透和包埋后，制作超薄切片，透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）下观察K256细胞超微结构。

　　1.7  流式细胞术测定PUVA 24 h后K562细胞的凋亡情况  取浓度为4.0×105/ml，处于对数生长期的K562细胞5 ml，分别加入PSO 0、10、20、40、80 μl，使其在反应体系中的终浓度分别为0、10、20、40、80 μg/ml，放入石英比色皿中，在GLY?10型光量子血液平衡治疗仪（λ=360 nm）上以1 J/m2辐射量边照射边震荡，照射时间分别为0 min和5 min。处理后各实验组细胞继续培养24 h，收集5.0×105个细胞，用PBS洗两次，弃上清，加入100 μl碘化丙啶染液，避光反应30 min，加入PBS 400 μl，上机检测，并用Multicycle软件分析得出相应的细胞凋亡百分率。

　　1.8  流式细胞术测定PUVA 24 h后K562细胞线粒体膜电位的变化情况  实验分组及处理方法同前，流式细胞仪检测PUVA 24 h后K562细胞线粒体膜电位（mitochondrial transmembrane potential, MTP），实验步骤参照JC?1试剂盒说明书进行。收集1×106个细胞，重悬于1 ml PBS中，加入200 μmol/L JC?1 10 μl，37 ℃、5% CO2孵育15～30 min，2 ml PBS洗1次，室温下离心（1 000 r/min）3 min，弃上清，加500 μl PBS，轻摇试管使细胞重悬，上机检测。用50 mmol/L 3?氯苯腙羰基氰化物(carbonyl cyanide 3?chlorophenyl?hydrazone, CCCP) 1 μl，37 ℃孵育5 min，进行荧光标准补偿。

　　1.9  统计学方法  所有实验结果均来自至少3组平行或3次重复实验。各种计量资料以x±s表示，采用计量资料的多因素方差分析；所有统计均用SPSS 11.5统计软件进行，检验水准α=0.05。

　　2  结果

　　2.1  透射电镜下观察PUVA后细胞超微结构改变  未经处理的K562细胞形态规则，胞浆量中等，胞核呈圆或椭圆形，核膜完整，内见散在分布染色质（图1A）。经PUVA处理后，1 500倍电镜下观察K562细胞出现体积缩小，胞浆浓缩，胞核体积减小，整个细胞可裂解成大小不一的凋亡小体（图1B）；4 000倍电镜下观察K562细胞胞核裂解成一个或数个致密体，核染色质聚集或边集，部分染色质致密成斑块状或沿核膜收缩成新月体状（图1C）。

　　2.2  PUVA对K562细胞凋亡的影响  与空白对照组比较，单纯UVA组和各浓度PSO组细胞凋亡率上升，差异有统计学意义（P<0.01）；各浓度PUVA组细胞凋亡率高于相同浓度的PSO组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

　　图1  80 μg/ml PUVA处理后K562细胞超微结构（略）

　　Figure 1  Ultrastructure change in K562 cells after 80 μg/ml PUVA treatment

　　A: K562 cells before 80 μg/ml PUVA treatment (TEM, ×4 000); B: K562 cells after 80 μg/ml PUVA treatment (TEM, ×1 500); C: K562 cells after 80 μg/ml PUVA treatment (TEM, ×4 000).

　　2.3  PUVA对K562细胞线粒体膜电位的影响  与空白对照组比较，单纯UVA组和各浓度PSO组线粒体膜电位下降，差异有统计学意义（P<0.01）；各浓度PUVA组线粒体膜电位低于相同浓度的PSO组，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。

　　表1  PUVA 24 h后K562细胞凋亡率和线粒体膜电位变化（略）

　　Table 1  Apoptosis ratios and MTP of K562 cells after 24?hour PUVA treatment

　　**P<0.01, vs normal control group; △△P<0.01, vs same dose PSO group.

　　3  讨论
   
　　补骨脂，又名胡韭子、婆固脂、破故纸等，为豆科一年生草本补骨脂的干燥成熟果实，性温，味辛、苦，归肾、脾经，具有补肾助阳、暖脾止泻、纳气平喘之功。《本草纲目》曰：“补骨脂言其功也，破固纸属火，可收敛神明，能使心包之火与命门之火相通，故元阳坚固，骨髓充实，补骨脂丸可壮筋骨，益元气。”药理研究表明，PSO是补骨脂的主要有效化学成分之一，它是一类杂环化合物。PSO具有抗肿瘤、抗白血病的作用，同时又具有光敏活性［2?5］。波长范围在320～360 nm之间的紫外光照射，可激发PSO的动力效应，从而增强其抗肿瘤及抗白血病的作用。显微镜和流式细胞仪检测结果显示，PUVA可诱导K562白血病细胞株发生凋亡。与K562细胞对照组（0 min UVA和0 μg/ml PSO）相比，单纯PSO和UVA以及PUVA均可增加细胞凋亡率，但多因素方差分析结果显示PUVA的作用要显著强于前两者，也再一次证明了PSO的光敏效应。
   
　　线粒体是细胞内三磷酸腺苷的主要生产中心，线粒体膜电位是由于线粒体内膜两侧质子及其他离子不平衡而形成的。在线粒体内、外膜交界处存在一种蛋白性孔道，即膜渗透性转换通道（permeability transition pore, PTP），多种刺激如氧化应激、超负荷、再灌注损伤等均可造成PTP开放［6］，引起线粒体膜电位的下降，呼吸链断裂，诱导细胞凋亡和死亡。本文结果显示，经PSO、UVA和PUVA处理的K562细胞线粒体膜电位均有下降，且统计分析结果显示，PUVA对K562细胞线粒体膜电位的影响要显著强于前两者。由此我们认为，PUVA诱导K562细胞凋亡的途径之一为下调细胞线粒体膜电位水平。

【】
  　　1 Chen NN, Huang SL, Zhang DJ, et al. The effects of psoralen and ultraviolet A on NB4, HL?60 and K562 leukemia cell lines. Zhongguo Zhong Yi Ji Zheng. 2007; 16(4): 444?446. Chinese with abstract in English.

　　陈楠楠, 黄世林, 张德杰, 等. 补骨脂素加长波紫外线对人白血病细胞株NB4、HL?60、K562作用的研究. 中医急症. 2007; 16(4): 444?446.

　　2 Wu SH, Zhang ZH, Zhao JB. Experimental study on antitumor activity of psoralen on mammary cancer cell line EMT6 in vitro and in vivo. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998; 23(5): 303?305. Chinese with abstract in English.

　　吴少华, 张仲海, 赵建斌. 补骨脂素体内外抗癌活性的实验研究. 中国中药杂志. 1998; 23(5): 303?305.

　　3 Carneiro Leite V, Ferreira Santos R, Chen Chen L, et al. Psoralen derivatives and longwave ultraviolet irradiation are active in vitro against human melanoma cell line. J Photochem Photobiol B. 2004; 76(1?3): 49?53.

　　4 Plumas J, Drillat P, Jacob MC, et al. Extracorporeal photochemotherapy for treatment of clonal T cell proliferations. Bull Cancer. 2003; 90(8?9): 763?770.

　　5 Efferth T, Fabry U, Osieka R. Induction of apoptosis, depletion of glutathione, and DNA damage by extracorporeal photochemotherapy and psoralen with exposure to UV light in vitro. Anticancer Res. 2001; 21(4A): 2777?2783.

　　6 Halestrap AP, Kerr PM, Javadov S, et al. Elucidating the mechanism of the permeability transition pore and its role in reperfusion injury of the heart. Biochim Biophys Acta. 1998; 1366(1?2): 79?94