青藤碱对膝骨性关节炎兔关节液及血清白细胞介素1β含量的影响
【摘要】 目的：探讨关节腔内注射青藤碱对膝骨关节炎兔关节液及血清中白细胞介素1β（interleukin?1β, IL?1β）含量的影响。
方法：除正常对照组（n=4）外，36只兔采用左后肢膝关节伸直位石膏管型制动法建立兔骨关节炎模型。造模6周后青藤碱组兔关节腔内注射青藤碱，1次/周，连续5周，透明质酸组关节腔内注射透明质酸，模型组关节腔内注射生理盐水，正常组不。分别于治疗前及治疗后采用酶联免疫吸附测定法检测关节液及血清IL?1β含量，并对软骨组织进行Mankin评分。
结果：与模型组比较，青藤碱组骨性关节炎兔血清及关节液中IL?1β含量下降（P<0.01），且青藤碱组低于透明质酸组（P<0.05）。青藤碱组的软骨Mankin评分明显低于透明质酸组（P<0.05）。
结论：青藤碱可能通过抑制关节液及血清中IL?1β表达降低兔骨性关节炎模型的关节退变程度。
【关键词】 骨性关节炎; 青藤碱; 白细胞介素1β; 兔
Methods: Degenerative osteoarthritis in the knee joint of left posterior limb was induced in 36 rabbits by full extension using plaster cast for 6 weeks. Then the rabbits were randomly divided into untreated group, hyaluronic acid group and sinomenine group. Another 4 normal rabbits were selected as normal control group. Rabbits in the sinomenine group and the hyaluronic acid group received intraarticular injections of sinomenine and hyaluronic acid once a week for 5 weeks, respectively. The content of IL?1β in synovial fluid and serum were measured before and after treatment by enzyme?linked immunosorbent assay. The pathological changes of cartilaginous tissue were analyzed by using Mankin's score.
Results: Compared with those in the untreated group, synovial fluid and serum IL?1β contents in the sinomenine group and the hyaluronic acid group were significantly decreased (P<0.01). And the synovial fluid and serum IL?1β contents in the sinomenine group were lower than those in the hyaluronic acid group (P<0.05). The mean Mankin's score of cartilage in the sinomenine group was significantly lower than that in hyaluronic acid group (P<0.05).
Conclusion: Sinomenine may reduce the degree of articular degeneration in rabbit with OA through decreasing the content of IL?1β in synovial fluid and serum.
Keywords: osteoarthritis; sinomenine; interleukin?1β; rabbits
骨性关节炎（osteoarthritis, OA）是以关节软骨退变和关节周围形成骨质增生为病理特征的慢性进行性骨关节病，是影响人类健康最常见的关节疾患之一。青藤碱是一种从中药青风藤的茎和根中提取的生物碱单体。研究表明青藤碱具有镇痛、抗炎和免疫调节等作用［1］。目前对于青藤碱的研究主要集中在治疗类风湿性关节炎的疗效及机制方面，而对于骨性关节炎的治疗则少有报道。本实验在建立兔膝骨关节炎模型的基础上，通过研究青藤碱对关节液及血清白细胞介素1β（interleukin?1β, IL?1β）的表达及对膝关节软骨超微结构的影响，初步探讨青藤碱治疗骨性关节炎的机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康5～6月龄日本大耳白兔40只，雄性，体质量2.2～2.6 kg（平均2.5 kg），由湖北省实验动物研究中心提供，实验动物许可证号为SCXK(鄂)2005?0016。
1.2 实验药物、主要试剂及仪器 IL?1β酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，上海西唐生物科技有限公司生产；番红O/固绿(safranin' O/fast green, S/F)染色剂，成都科比特生物技术有限公司生产；青藤碱注射剂，50 mg/支（2 ml），湖南正青集团公司生产，批号为050912032；透明质酸（施沛特）注射剂20 mg/支（2 ml），由山东正大福瑞达制药公司生产，批号为051006031。美国Thereto公司酶标仪（Wellwash 4MK2型），德国HERAUS公司台式离心机（B4I?BR4I型），上海一恒科技有限公司电热恒温水箱（DK?600A型）。
1. 3 动物模型的制备 按Videman［2］的管型石膏伸直位制动法建立骨性关节炎模型。取36只实验兔进行造模，将其左后肢腹股沟以下1.5 cm至踝关节下3 cm（趾端）用石膏管型固定于伸直位，踝关节背屈30～40度，制动6周。造模期间采用一笼一兔喂养，每天检查石膏固定的情况，并及时进行修复。6周后去除石膏。
1.4 实验分组及给药方法 制动6周后，将骨性关节炎模型兔随机分为模型组、透明质酸组和青藤碱组，每组12只，另取4只正常实验兔作为正常组。给药方法为关节腔内注射，注射针头进针约0.4～0.7 cm，当感到阻力消失且有突破感时表示已进入关节腔。药物根据成人用药剂量（青藤碱和透明质酸均为2 ml/次）按Meeh?Rubner公式［3］人兔等效剂量。青藤碱组给予青藤碱注射剂0.2 ml/次（相当于2 mg/kg），透明质酸组给予透明质酸注射剂0.2 ml/次（相当于0.8 mg/kg），模型组关节腔注入0.2 ml生理盐水，1次/周，连续5周。正常组不给予任何处理。全部动物于末次给药后1周处死并取材。
1.5 IL?1β含量检测 所有实验兔分别于造模成功后及治疗5周后，膝关节注入无菌生理盐水1.0 ml，在关节内混匀后抽取，离心后每膝获取200 μl关节液，－20 ℃保存。同时留取耳缘静脉血0.5 ml，并分离血清，－20 ℃冰箱内保存。实验操作时取血清及关节液各100 μl进行检测。IL?1β含量检测采用ELISA双抗体夹心法，严格按照药盒说明书进行操作。采用酶标仪检测450 nm处的吸光度（optical density, OD）值，并计算IL?1β含量。
1.6 关节软骨病理观察及Mankin评分 取实验动物双侧股骨内髁软骨，10%中性甲醛固定48 h，5%硝酸脱钙，常规乙醇逐级脱水，石蜡包埋。将股骨内髁标本行矢状面平行切片，切片厚约7 μm，每个标本贴片两张：一张常规HE染色，一张行S/F染色。行S/F染色时将切片常规脱蜡、水化，魏格特氏铁苏木素溶液（Weigert’s iron hematoxylin）染色5 min，蒸馏水流水冲洗10 min，酸性酒精分色15 s，蒸馏水流水冲洗3 min，0.02%固绿染色5 min，1%乙酸洗15 min，0.1%番红O染色5 min，常规酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片，光学显微镜下观察。采用Mankin评分方法［4］，确定关节软骨的受损程度。
1.7 统计学方法 本研究采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析，行多组间两两比较，所得数据以x±s表示，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 血清和关节液IL?1β含量 造模结束后，模型组大鼠关节液及血清中IL?1β含量与正常组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。治疗后，与模型组比较，青藤碱组与透明质酸组大鼠关节液及血清中IL?1β含量下降，差异有统计学意义（P<0.01）；与透明质酸组血清及关节炎中IL?1β含量比较，青藤碱组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
表1 各组血清及关节液IL?1β含量变化（略）
Table 1 Changes of IL?1β contents in synovial fluid and serum in four groups
**P<0.01, vs untreated group; △P<0.05, vs hyaluronic acid group.
2.2 股骨髁软骨标本的肉眼观察 正常对照组软骨表面稍有不光滑，软骨颜色开始变白，表面无糜烂。模型组软骨表面粗糙、肥厚，有中到重度糜烂，软骨苍白，质软，有的可见软骨下骨暴露。透明质酸组软骨表面粗糙，肥厚、糜烂程度较青藤碱组为重，软骨苍白，质软，但尚未见软骨下骨暴露。青藤碱组兔关节软骨略粗糙，轻到中度糜烂，软骨苍白，较软。
2.3 股骨髁软骨光学显微镜下观察 青藤碱组股骨髁软骨HE染色可见软骨出现裂隙，可达切线层和过渡层，出现了细胞增生或轻度细胞克隆化形成的软骨细胞簇，有多重潮线，番红O染色轻到中度减少。透明质酸组软骨的裂隙深入放射层，有细胞克隆化形成的软骨细胞簇，或有细胞减少，有多重潮线和潮线被毛细血管穿破现象，番红O染色中到重度减少。模型组软骨的裂隙可达钙化层，甚至结构被完全破坏，细胞减少，软骨下骨增生，番红O极少染色。正常对照组关节软骨表面多光滑，细胞正常或有轻度增生，潮线多完整，番红O染色均匀。见图1和图2。
图1 HE染色观察关节软骨病理切片 (光学显微镜，×100)（略）
Figure 1 Pathological sections of articular cartilage by HE staining (Light microscopy, ×100)
A: Normal control group; B: Untreated group; C: Hyaluronic acid group; D: Sinomenine group.
图2 S/F染色观察关节软骨病理切片(光学显微镜，×100)（略）
Figure 2 Pathological sections of articular cartilage by S/F staining (Light microscopy, ×100)
A: Normal control group; B: Untreated group; C: Hyaluronic acid group; D: Sinomenine group.
2.4 关节软骨Mankin评分 青藤碱组及透明质酸组Mankin评分低于模型组（P<0.01）。青藤碱组关节软骨Mankin评分低于透明质酸组（P<0.05）。见表2。
表2 各组关节软骨Mankin评分（略）
Table 2 Mankin's score of articular cartilage in four groups
**P<0.01, vs untreated group; △P<0.05, vs hyaluronic acid group.
3 讨论
OA是风湿科临床上常见的疾病，以关节软骨破坏，软骨下骨异常病变，边缘骨质增生为其病理特征。OA的发病机制十分复杂，可能是由负荷传导紊乱、关节软骨酶、细胞因子、骨内压升高和性激素紊乱等众多因素共同参与所致。IL?1在改变软骨细胞正常结构和功能，促进软骨细胞凋亡发生，降解软骨细胞基质，参与滑膜炎性病变及影响代谢等方面均发挥作用［5］。IL?1对关节软骨细胞代谢的干扰作用主要表现为：抑制透明软骨特征性Ⅱ、Ⅸ型胶原蛋白的合成，破坏软骨基质的胶原纤维网；促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成而使软骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和合成蛋白多糖［6］。IL?1可刺激软骨细胞分泌前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2），诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)的形成，从而加速基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原的降解，提高Ⅰ型胶原的合成，激活诱导型一氧化氮合酶表达，产生一氧化氮(nitric oxide, NO)，从而诱导软骨细胞凋亡，同时诱导IL?6、IL?8和IL?18的产生［7］。因此，抑制IL?1所造成的滑膜炎性反应及关节软骨的退变，成为防治OA骨质破坏的关键。
青藤碱是从防己科植物毛青藤中提取的一种生物碱单体，从化学结构上看，由氢菲核和乙胺桥组成，结构类似吗啡。有研究表明，通过检测IL?1β、NO合成以及TNF?α mRNA表达及生物合成，发现青藤碱能够抑制NO合成，下调IL?1β的表达［8］。青藤碱可显著下调突变型p53的表达，抑制滑膜细胞过度增生并诱导其凋亡，减轻胶原诱导型大鼠的关节炎症［9］；抑制巨噬细胞的炎性物质PGE2和白三烯合成，降低细胞中NO合成而抑制关节炎症［10］；下调单核/巨噬细胞核转录因子κB（nuclear factor?κB, NF?κB）的活性，干预NF?κB信号通路的某些环节，抑制细胞因子TNF?α、IL?lβ及IL?10 mRNA的表达及分泌，产生抗炎作用［11］。
本实验发现，青藤碱和透明质酸均能在一定程度上抑制血清及关节液中IL?1β的分泌，且青藤碱对IL?1β的抑制作用优于透明质酸，提示青藤碱对骨性关节炎的滑膜炎症起到作用。软骨组织组织化学染色结果显示，治疗5周后青藤碱组及透明质酸组软骨退变程度轻于模型组，提示青藤碱有减缓软骨降解、保护软骨的作用。Mankin评分显示，青藤碱对软骨退变的延缓优于透明质酸，证明了青藤碱能够在一定程度上延缓OA的病变进程，可能对OA有一定的防治作用。OA所造成的关节损伤存在着多种复杂的原因，不单只是一种细胞因子的参与。青藤碱对OA炎症反应的改善及延缓关节软骨退变是否存在对其他相关因素及途径的调节仍有待于进一步研究。
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