益气化瘀补肾方对大鼠肾虚型颈椎病的作用机制
作者：江建春, 李晨光, 周泉, 卞琴, 梁倩倩, 崔学军, 卢盛, 周重建, 施杞, 王拥军
【摘要】 目的：研究益气化瘀补肾方对大鼠肾虚型颈椎病的作用机制。
方法：选择3月龄雌性SPF级SD大鼠30只，随机分为正常对照组、肾虚型颈椎病模型组（简称模型组）和益气化瘀补肾方组，每组10只。除正常对照组不施加任何手术外，采用由动静力失衡大鼠颈椎间盘退变模型和去卵巢肾虚模型复合法建立肾虚型颈椎病模型。手术3个月后，益气化瘀补肾方组大鼠予益气化瘀补肾方灌胃1个月。放射免疫法检测血清雌二醇（estradiol, E2）和血浆环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）、环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate, cGMP）含量；锥板法检测血液流变学；流式细胞仪检测血小板表面α?颗粒膜糖蛋白（alpha?granular membrane protein, CD62p）表达；HE染色观察颈椎间盘组织病改变，免疫组织化学检测颈椎间盘Ⅱ型胶原蛋白表达情况，并通过实时荧光定量聚合酶链式反应法检测聚集蛋白聚糖（aggrecan?1, Agc1）、Ⅱ型前胶原基因（type Ⅱ procollagen gene, Col2a1）、基质金属蛋白酶抑制剂?1（tissue inhibitor of metalloproteinase?1, TIMP?1）、基质金属蛋白酶?13（matrix metalloproteinase?13, MMP?13） mRNA表达。
结果：与模型组比较，益气化瘀补肾方组大鼠血清E2含量升高（P<0.05）；血浆cAMP、cGMP含量有所升高，但差异无统计学意义；全血低切黏度、低切还原黏度和CD62p表达百分率下降（P<0.05或P<0.01）；颈椎间盘退变有所改善，Miyamoto评分下降（P<0.05），Ⅱ型胶原表达增加；Agc1、Col2a1和TIMP?1 mRNA表达增加（P<0.05，P<0.01），MMP?13 mRNA表达下降（P<0.01）。
结论：益气化瘀补肾方可通过调节免疫系统、代谢系统、凝血系统和内分泌系统等指标，改善肾虚型颈椎病证候指标，并延缓椎间盘退变。
【关键词】 益气化瘀补肾方; 肾虚; 颈椎病; 大鼠
Objective: To research the action mechanism of Yiqi Huayu Bushen Recipe (YHBR), a compound of traditional Chinese herbal medicine, in treating cervical syndrome (CS) with kidney deficiency in rats.
Methods: A total of 30 three?month?old female Sprague?Dawley rats were randomly divided into normal control group, CS with kidney deficiency model group (untreated group) and YHBR group, with 10 rats in each group. Rats in the normal control group received no treatment, while rats of the other two groups underwent resection of both cervical muscles and ovaries to establish the model of CS with kidney deficiency. Three months after surgery, rats in the YHBR group were intragastricly administered YHBR for one month. Another one month later, all rats were sacrificed. The content of serum estradiol (E2) was detected by radio?immunoassay; contents of plasma cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) were tested, and the ratio of cAMP/cGMP was also calculated. Hemorheology was detected by Weissenberg's method; expression of alpha?granular membrane protein (CD62p) was detected by flow cytometry; HE staining was used to detect the histopathology of cervical intervertebral disc degeneration; type Ⅱ collagen protein was detected by immunohistochemistry and aggrecan?1 (Agc1), type Ⅱ procollagen gene, Col2a1, tissue inhibitor of metalloproteinase?1 (TIMP?1) and matrix metalloproteinase?13 (MMP?13) mRNAs were detected by fluorescent quantization polymerase chain reaction.
Results: Compared with the untreated group, rats in the YHBR group showed an obvious increase in serum E2 content (P<0.05), and an increase in plasma cAMP and cGMP content without significant difference; hemorheological parameters and percentage of CD62p expression were significantly decreased in the YHBR group (P<0.05, P<0.01). YHBR could improve the degeneration of cervical intervertebral discs, decrease the Miyamoto scores (P<0.05), and increase the type Ⅱ collagen. The expressions of Agc1, Col2a1 and TIMP?1 mRNAs were significantly increased and MMP?13 mRNA significantly decreased in YHBR group (P<0.05, P<0.01).
Conclusion: YHBR may improve CS with kidney deficiency and delay the degeneration of cervical intervertebral disc by regulating the immune?metabolism system, coagulation system and endocrine system.
Keywords: Yiqi Huayu Bushen Recipe; kidney deficiency; cervical syndrome; rats
益气化瘀补肾方（Yiqi Huayu Bushen Recipe, YHBR）是施杞教授治疗颈椎病的经验方，本研究在建立肾虚型颈椎病动物模型的基础上，采用益气化瘀补肾方进行治疗，探讨该方对肾虚型颈椎病的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 3月龄SPF级SD雌性大鼠30只，体质量（240±20）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号为SCXK（沪）2003?0003。
1.1.2 主要仪器 全自动石蜡包埋机、组织脱水机和轮转式切片机（德国Leica公司，型号分别为EG1160型、TP1020型和RM2135型），光学显微镜和图像分析系统（日本Olympus公司，BH?20型），紫外/可见光分光光度计（美国Beckman公司，DU 800/VIS型），四通道荧光实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）仪（澳大利亚Cobett公司，Rotor Gene 3000型），基因扩增仪(德国Eppendorf公司，Mastercycler Personal型)，γ放免计数器（院上海原子核研究所日环仪器厂，SN?682型），流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司, FACS Calibur型），全自动清洗血流变仪（北京普利生仪器有限公司，LBY?N6C型）。
1.1.3 主要药物和试剂 盐酸氯胺酮（上海第一生化药业公司，国药准字H31021897），益气化瘀补肾方，由黄芪15 g、党参12 g、川芎9 g、丹参9 g、补骨脂15 g、肉苁蓉15 g和人工麝香0.03 g等组成（上海中医药大学龙华制剂中心提供）。雌二醇（estradiol, E2）放射免疫分析药盒（北京北方生物技术研究所），125I?环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）、125I?环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate, cGMP）放射免疫分析试剂盒（上海中医药大学核医学实验室），Ⅱ型胶原兔抗鼠抗体（美国Cell Signaling Technology公司)，Ⅹ型胶原兔抗鼠抗体（武汉博士德生物工程有限公司），Ⅱ型胶原蛋白表达免疫组化试剂盒（晶美生物工程有限公司），聚集蛋白聚糖（aggrecan?1, Agc1）、Ⅱ型前胶原基因（type Ⅱ procollagen gene, Col2a1）、基质金属蛋白酶?13（matrix metalloproteinase?13, MMP?13）和基质金属蛋白酶抑制剂?1（tissue inhibitor of metalloproteinase?1, TIMP?1）引物（大连浩嘉生物技术有限公司），藻红蛋白（phycoerythrin, PE）标记鼠抗人血小板表面α?颗粒膜糖蛋白（alpha?granular membrane protein, CD62p）抗体(英国Serotec 公司)，TRIzol试剂（美国MRC公司），逆转录酶（北京天根生化科技有限公司）。
1.2 分组与造模方法
1.2.1 分组方法 将30只大鼠按随机区组设计，分为正常对照组、肾虚型颈椎病模型组（简称模型组）和益气化瘀补肾方组，每组10只。
1.2.2 造模方法 肾虚型颈椎病模型建立方法参照［1］，当颈椎病模型造模3个月后，正常对照组和模型组正常饲养(不予灌胃治疗)，益气化瘀补肾方组予益气化瘀补肾方治疗1个月，用药剂量按动物体表面积比率换算等剂量法［2］，由正常成人每天常用剂量换算得出，大鼠按平均体质量320 g，正常成人按60 kg标准体质量计算。中药水煎剂灌胃给药，含生药量0.687 g/ml，1次/d，3 ml/次。治疗结束后第2天取材。
1.3 指标检测
1.3.1 子宫及附件质量 大鼠用戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，取出子宫及附件，为了与模型组和益气化瘀补肾方组相统一，正常对照组子宫及附件去除双侧卵巢后，用天平称量子宫及附件的质量。每组取8个样本，进行统计分析。
1.3.2 血清E2含量 大鼠用戊巴比妥麻醉后，腹主动脉采血2 ml，摇匀放入水浴中20 min，离心（2 000 r/min 10 min），取血清，按照试剂盒说明书操作要求，用放射免疫法测定血清E2含量，实验由上海中医药大学核医学实验室完成。由于实验过程中的意外或失误（其他血液样本原因同此），使各组用于测量E2的样本量分别为8、7、7。
1.3.3 血浆cAMP和cGMP含量 上述方法采血1 ml，乙二胺四乙酸抗凝，离心，取血浆，按照试剂盒说明书操作要求，用放射免疫法测定血浆cAMP和cGMP含量，并计算cAMP/cGMP比值。实验由上海中医药大学核医学实验室完成，各组样本量分别为7、9、9。
1.3.4 血液流变学指标 上述方法采血5 ml，肝素抗凝，摇匀，按锥板法采用全自动自清洗血流变仪检测血液流变学指标。各组样本量分别为10、9、9。
1.3.5 血CD62p表达检测 上述方法采血1 ml，肝素抗凝，用流式细胞仪检测CD62p的表达。取0.1 ml抗凝血，加入PE标记鼠抗人CD62p抗体20 μl，混合，4 ℃放置20 mim；加2 ml红细胞溶解液放置10 min 破红细胞；离心2 000 r/min，5 min，弃上清液；用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, PBS）洗涤细胞2～3次，再悬浮于0.3 ml PBS中，用流式细胞仪检测CD62p的表达。各组样本量分别为8、9、8，实验由中国科学院上海生命科学研究院细胞所完成。
1.3.6 颈椎间盘组织病理学 取颈椎间盘，4%多聚甲醛固定24 h，清水冲洗后，20%乙二胺四乙酸脱钙4周，脱水，透明，包埋，连续6 μm横断面切片，HE染色。在40倍光学显微镜下观察每个正中矢状面椎间盘。按Miyamoto分级评分标准将椎间盘退变程度分为1～5级［3］，分别定为1、2、3、4和5分。每组随机取8个样本。
1.3.7 颈椎间盘Ⅱ型胶原蛋白表达 采用免疫组化方法，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。棕黄色为阳性染色，各个标本在200倍光学显微镜下观察。
1.3.8 颈椎间盘Agc1、Col2a1、MMP?13和TIMP?1基因表达 用TRIzol法抽提mRNA，逆转录后，采用实时荧光定量PCR的方法检测基因表达，引物及方法参照文献［1］。用6个样本进行统计，结果用待测基因与β?actin灰度值的比值表示。
1.4 统计学方法 采用 SPSS 13.0软件进行统计分析，实验数据用x±s表示，采用单因素方差分析比较组间差异。
2 结果
2.1 子宫及附件质量 与正常对照组比，模型组和益气化瘀补肾方组大鼠子宫及附件质量明显降低（P<0.01）。益气化瘀补肾方组与模型组比较，差异无统计学意义。见表1。
表1 子宫及附件质量（略）
Table 1 Weight of uterus and appendages in different groups
**P<0.01, vs normal control group.
2.2 血清E2含量 与正常对照组比较，模型组血清E2含量降低，但差异无统计学意义，益气化瘀补肾方组与模型组比较，血清E2含量明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
表2 血清E2含量（略）
Table 2 Content of serum E2 in different groups
△P<0.05, vs untreated group.
2.3 血浆cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值 与正常对照组比较，模型组大鼠血浆cAMP含量下降（P<0.05）；益气化瘀补肾方组血浆cAMP含量高于模型组，但差异无统计学意义；血浆cGMP含量和cAMP/cGMP比值各组间比较，差异无统计学意义。见表3。
2.4 血液流变学变化 与正常对照组比较，模型组全血低切黏度、全血高切黏度和低切还原黏度明显增高（P<0.01）；益气化瘀补肾方组全血高切黏度高于正常对照组（P<0.05），全血低切黏度和低切还原黏度低于模型组（P<0.05）；各组间聚集指数比较，差异无统计学意义。见表4。
表3 血浆cAMP和cGMP含量及cAMP/cGMP比值（略）
Table 3 Contents of plasma cAMP and cGMP and ratio of cAMP/cGMP in different groups
*P<0.05, vs normal control group.
表4 血液流变学指标变化（略）
Table 4 Changes of hemorheological parameters in different groups
*P<0.05, **P<0.01, vs normal control group; △P<0.05, vs untreated group.
2.5 血CD62p表达 与正常对照组比较，模型组和益气化瘀补肾方组CD62p表达明显增高（P<0.01）；与模型组比较，益气化瘀补肾方组大鼠血CD62p表达降低（P<0.01）。见表5。
2.6 颈椎间盘组织病
2.6.1 颈椎间盘HE染色 正常对照组大鼠颈椎间盘纤维环排列稍紊乱，有的出现裂隙，髓核有皱缩，软骨终板分为生长软骨层和关节软骨层，关节软骨层较薄，潮标清晰可见；模型组颈椎间盘纤维环出现裂隙，胶原纤维排列紊乱，髓核纤维化，软骨终板高度变小，潮标前移；益气化瘀补肾方组颈椎间盘退变有所改善，纤维环排列稍紊乱，髓核皱缩，软骨终板与模型组比较厚度增大，潮标后移。见图1。
表5 血CD62p表达（略）
Table 5 Expression of CD62p in different groups
**P<0.01, vs normal control group; △△P<0.01, vs untreated group.
图1 颈椎间盘HE染色（光学显微镜，×40）（略）
Figure 1 HE staining of cervical intervertebral disc (Light microscopy, ×40)
A: Normal control group; B: Untreated group; C: YHBR group.
2.6.2 颈椎间盘退变程度分级 与正常对照组比较，模型组和益气化瘀补肾方组大鼠颈椎间盘退变程度Miyamoto评分分值增高（P<0.05）；益气化瘀补肾方组分值低于模型组（P<0.05）。见表6。
2.7 颈椎间盘Ⅱ型胶原免疫组化染色 正常对照组Ⅱ型胶原在髓核、纤维环和软骨终板均有分布；与正常对照组比较，模型组Ⅱ型胶原表达减少，主要表达在纤维环；与模型组比较，益气化瘀补肾方组Ⅱ型胶原表达增加。见图2。
表6 颈椎间盘Miyamoto评分（略）
Table 6 Miyamoto scores of cervical intervertebral disc in different groups
*P<0.05, vs normal control group; △P<0.05, vs untreated group.
图2 颈椎间盘纤维环Ⅱ型胶原免疫组织化学染色（光学显微镜，×200）（略）
Figure 2 Immunohistochemical staining of type Ⅱ collagen in annulus fibrosus of cervical intervertebral disc (Light microscopy, ×200)
A: Normal control group; B: Untreated group; C: YHBR group.
2.8 颈椎间盘Agc1、Col2a1、MMP?13和TIMP?1 mRNA表达 与正常对照组比较，模型组颈椎间盘Agc1、Col2a1、TIMP?1 mRNA表达降低，MMP?13表达增高，其中Agc1、Col2a1和MMP?13 mRNA表达差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。与模型组比较，益气化瘀补肾方组Agc1、Col2a1和TIMP?1 mRNA表达增高（P<0.05，P<0.01），MMP?13表达降低（P<0.01）。见表7。
表7 颈椎间盘Agc1、Col2a1、MMP?13和TIMP?1 mRNA表达（略）
Table 7 Expressions of Agc1, Col2a1, MMP?13 and TIMP?1 mRNAs in cervical intervertebral disc in three groups
*P<0.05, **P<0.01, vs normal control group; △P<0.05, △△P<0.01, vs untreated group.
3 讨论
颈椎病的发生离不开气血失和和经脉不遂等因素，也与肾关系密切。《素问·六节脏象论》：“肾者主蛰，封藏之本，精之处也。”《灵枢·本神》曰：“生之来者谓之精。”精指先天之精气，即肾气，它对人体之生长、发育及形体之盛衰始终起着主导作用。《张氏医通》云：“有肾气不循故道，气逆挟脊而上，至肩背痛。”提出了肾与颈椎病的相关性。与颈椎病发生相关的因素中，椎体骨质增生、骨质疏松都与肾气是否充盈、骨与髓能否得到滋养不无关系，但同时伴有气虚血瘀的表现。
肾实质研究表明，性激素水平可作为肾虚证的指标［4］。实验中大鼠子宫及附件质量降低、血清E2含量下降，说明模型组动物存在明显的肾虚证。颈椎病的病理改变是椎间盘的退变，颈椎间盘组织的病理学表现，细胞外基质的基因和蛋白表达的减少，降解酶活性的增高，充分说明模型组和益气化瘀补肾方组颈椎间盘均发生了一定程度的退变。此外，血浆cAMP、cGMP含量，血液流变学和CD62p的变化，说明模型组动物不仅有明显的肾虚证，还存在免疫、代谢系统和凝血系统的异常。益气化瘀补肾方组与模型组比较，血清E2含量增高，cAMP、cGMP恢复平衡，血液流变学指标改善，CD62p降低，椎间盘形态改善，细胞外基质合成增多，降解酶活性减少，说明益气化瘀补肾方对肾虚型颈椎病有多方面作用。
益气化瘀补肾方中黄芪不仅有明显的增强免疫功能的作用［5?7］，还有扩张血管、降低区域血管阻力，保护血管内皮细胞，改善微循环，促进血管生成的作用［8］。川芎的有效成分川芎嗪和阿魏酸等具有清除氧自由基、钙拮抗、扩血管、抗血小板聚集和抗血栓形成等多种作用［9］。补骨脂为补肾药，有较强的雌激素样作用［10］，还能通过调节神经和血液系统，促进骨髓造血，增强免疫和内分泌功能，从而发挥抗衰老延寿作用。益气化瘀补肾方是否分别通过免疫系统、代谢系统、凝血系统和内分泌系统等途径对颈椎间盘退变起作用值得进一步研究。
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