滋补肝肾、通络解毒中药对异动症大鼠行为学及纹状体多巴胺D2受体活性的影响

【摘要】  观察滋补肝肾、通络解毒中药对异动症大鼠行为学和多巴胺D2受体活性的影响。 方法：采用6?羟基多巴胺（6?hydroxydopamine，6?OHDA）注射于大鼠脑右侧黑质造成偏侧帕金森病（Parkinson's disease，PD）模型，进一步对PD大鼠予以左旋多巴/苄丝肼制作异动症(levodopa?induced dyskinesias，LID)模型。实验设立正常对照组、模型组、中药干预组、中止给药对照组和中止给药＋中药干预组，观察中药对LID大鼠异常不自主运动（abnormal involuntary movement, AIM）评分的影响，测定大鼠纹状体多巴胺D2受体的最大结合容量（maximum binding capacity，Bmax）和平衡解离常数（equilibrium dissociation constant, KD），来评价中药对LID大鼠多巴胺D2受体亲和力的影响。结果：与模型组和中止给药对照组比较，中药干预组可明显减少异动症大鼠的AIM积分（P<0.01）；纹状体多巴胺D2受体亲和力检查示，中药可使Bmax显著上调（P<0.05，P<0.01），KD值下降（P<0.01），多巴胺D2受体亲和力显著提高。结论：滋补肝肾、通络解毒中药可以有效缓解异动症症状，明显改善纹状体多巴胺D2受体活性。

【关键词】  异动症 中药 多巴胺D2受体 神经行为学表现 大鼠

      Objective: To explore the effect of traditional Chinese herbal medicine (TCM) for nourishing liver and kidney, clearing meridians and removing toxic substances, on the neurobehavioral manifestations and the activity of the dopamine D2 receptor in rat with levodopa?induced dyskinesias (LID).

    Methods: The rat model of Parkinson's disease (PD) was established by injecting 6?hydroxydopamine (6?OHDA) into right substantia nigra of brain, then, the model of LID in rat was produced by injecting levodopa (LD) and benserazide for 4 weeks. The rats were divided into normal control group, 4?week LD treated group, 4?week LD plus TCM treated group, 8?week LD treated group, and 8?week LD plus TCM treated group, and the effect of the TCM on neurobehavioral manifestations was observed. The radioligand binding assay (RLBA) and Scatchard drawing were used to measure the maximal binding capacity of receptor (Bmax) and equilibrium dissociation constant (KD) of the dopamine D2 receptor in corpora striatum.

    Results: Compared with the 4?week LD treated group and 8?week LD treated group, TCM could decrease abnormal involuntary movement scores of the rats with LID; the RLBA revealed that the dopamine D2 receptor Bmax significantly increased (P<0.05, P<0.01) and the KD significantly decreased (P<0.05).

    Conclusion: TCM can improve the activity of the dopamine D2 receptor and relieve the symptoms of LID.

    Keywords: levodopa?induced dyskinesias; traditional Chinese herbal medicine; dopamine D2 receptor; neurobehavioral manifestations; rats

    异动症（levodopa?induced dyskinesias, LID）是左旋多巴（levodopa, LD）长期帕金森病（Parkinson's disease，PD）过程中普遍出现的并发症，主要表现为舞蹈症和手足徐动症，严重影响帕金森病患者的日常生活质量。目前，各国学者在努力寻找PD病因的同时将研究重点集中在如下两方面：一是如何阻止或减缓黑质多巴胺能神经元的进行性变性；二是如何减少左旋多巴制剂毒副作用。本研究主要探讨滋补肝肾、通络解毒中药对LID大鼠行为学和纹状体多巴胺D2受体数量及亲和力的影响。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  实验药物  滋补肝肾、通络解毒中药——熟地平颤汤颗粒合用蝎蜈胶囊为上海市名中医胡建华教授经验方，熟地平颤汤颗粒由熟地黄15 g、枸杞15 g、桑寄生20 g、天麻15 g、僵蚕10 g、莪术15 g、白芍药20 g和天南星15 g组成，由江阴天江药业有限公司制成颗粒剂（批号：0504312），每袋重4.8 g，相当于生药31.25 g。蝎蜈胶囊（批号：010813）按全蝎︰蜈蚣=1︰1配制，烘干打粉，灌制胶囊，每粒含生药0.3 g。将4袋熟地平颤汤颗粒和10粒蝎蜈胶囊（相当于成人1 d用量，含生药128 g）混合后溶于100 ml生理盐水中，使每毫升含生药1.28 g。LD粉剂5 g（批号：SLD6382）和苄丝肼粉剂5 g（批号：SL06492），由美国Sigma公司提供。

    1.1.2  主要试剂和仪器  6?羟基多巴胺（6?hydroxydopamine，6?OHDA)、阿朴吗啡（apomorphine，APO)和布他拉莫，美国Sigma公司产品；3H?螺环哌啶酮和闪烁液，美国PerkinElmer公司产品。大鼠脑立体定位仪，TOW?3A型，第二军医大学产品；超速离心机，LE80K型，Beckman公司产品；液体闪烁发光记数仪，Wallac1450型，美国PerkinElmer公司产品。

    1.1.3  实验动物  成年雄性SD大鼠30只，体质量180～220 g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供,动物许可证号为SCXK沪2003?0002。

    1.2  实验方法

    1.2.1  PD大鼠模型制备  PD大鼠模型制备参照［1］方法，SD大鼠用1%戊巴比妥麻醉后，固定于大鼠脑立体定向仪上，参照包新民等［2］所著大鼠脑立体定位图谱，确定右侧黑质致密部（substantia nigra pars compacta，SNC)和中脑腹侧被盖部(ventral tegmental area，VTA)三维坐标位置，SNC为前囟后4.8 mm、矢状缝右侧2.0 mm、硬膜下8.0 mm；VTA为前囟后4.8 mm，矢状缝右侧1.2 mm，硬膜下8.2 mm。牙科钻打孔，向两坐标点各注射6?OHDA 6 μg（溶于含0.2%抗坏血酸的生理盐水中，6?OHDA浓度为2 g/L），注射速度为1 μl/min，留针10 min。术后，用医用明胶海绵填塞颅骨孔，缝合切口皮肤，伤口上涂抹磺胺颗粒抗感染，待动物清醒后放回饲养笼中饲养。术后2周腹腔注射阿朴吗啡（0.5 mg/kg体质量）诱发大鼠旋转，记录注射后30 min内大鼠旋转方向和旋转圈数，若大鼠恒定转向右侧且旋转圈数>7 r/min则视为PD模型成功。

    1.2.2  LID大鼠模型制备  对成功的PD大鼠予左旋多巴/苄丝肼治疗（10 mg/ml左旋多巴和2.5 mg/ml苄丝肼溶于含0.2％维生素C的消毒生理盐水中），制备LID大鼠模型［3］，左旋多巴的注射剂量为10 mg/kg体质量，每天9时和17时进行腹腔注射，持续4周。根据其是否出现刻板动作和对侧旋转行为等异常不自主运动（abnormal involuntary movement，AIM），筛选出LID模型，AIM评分>20分则视为LID模型成功。

    1.2.3  动物分组及给药  左旋多巴用药4周后，将成功建立的LID模型大鼠，分为模型组(8周模型组)、中药干预组、中止给药对照组(4周模型组)、中止给药+中药干预组，每组6只，再另取6只未造模大鼠为正常对照组。正常对照组及中止给药对照组给予生理盐水灌胃，模型组继续予以左旋多巴/苄丝肼腹腔注射（注射剂量为10 mg/kg），中药干预组在模型组处理基础上给予中药灌胃，中止给药+中药干预组则在4周时停用左旋多巴/苄丝肼的基础上加用中药（同中药干预组），每次灌胃量为9 ml/kg，1次/d，连续4周。

    1.2.4  AIM评分测定  除正常对照组大鼠外，模型各组大鼠于观察期间每周进行AIM评分，参照文献方法［4］，将AIM分为4个部分（前肢AIM、口面部AIM、轴性AIM及运动AIM）进行评定，每部分又根据其有无和严重程度划分为5个等级，计为0～4分，其中0分为无；1分为偶尔出现；2分为经常出现；3分为持续存在，刺激使之停止；4分为持续存在，刺激也不能使之停止。理论上1只大鼠1次腹腔注射左旋多巴/苄丝肼后的AIM最高评分为64分。评分在左旋多巴/苄丝肼腹腔注射后立即进行，30 min评定1次，共120 min，5组数据平均值为本次的AIM分数。

    1.2.5  膜蛋白制备  参照张旺明等［5］方法制备膜蛋白，大鼠以10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，快速断头取脑，于冰块上分离并切取双侧尾壳核脑组织各1块。加入4 ℃预冷的Tris?盐酸缓冲液，冰浴中制成匀浆，离心后，取沉淀以Tris?盐酸缓冲液（pH 7.4）1～2 ml稀释，充分混悬，即成膜蛋白悬液。以考马斯亮蓝法测定膜蛋白浓度，并用Tris?盐酸缓冲液调整膜蛋白浓度为1 g/L左右。

    1.2.6  多巴胺D2受体活性的测定  采用双复管法（每个样本分为9个不同浓度反应管，重复测定2次）测定，反应管内加入浓度呈倍比递增的标记配基（特异性结合：10、20、40、60、80和100 μl。非特异性结合：20、60和100 μl）和非标记配基（非特异性结合：100 μl)以及定量的膜蛋白液0.2 ml，加入Buffer缓冲液，使每管总反应体积为0.4 ml，37 ℃水浴中孵育15 min，于冰浴中终止反应。以多头细胞样品收集器收集于玻璃纤维滤纸上，置80 ℃烘箱中烤干，剪下样品，以2000CA/LL型液态闪烁计数仪测定其放射活性，以空白滤纸点样进行校正。各点特异性结合计数，使用受体数据软件包（上海第二医科大学编制），按Scatchard公式计算出多巴胺受体的最大结合容量（maximum binding capacity, Bmax）和平衡解离常数（equilibrium dissociation constant, KD）。

    1.3  统计学方法  采用SPSS 13.0统计软件包进行数据分析，采用单因素方差分析及t检验进行组间比较，结果用x±s表示，检验水准α=0.05。

    2  结  果

    2.1  各组大鼠给药前后AIM评分的变化  与用药前比较，模型组大鼠用药后第1、2、3和4周的AIM评分逐步增高（P<0.01）。与同期模型组比较，中药干预组大鼠第1周AIM评分差异无统计学意义，自第2周开始下降，第3和4周的AIM评分值低于同期模型组（P<0.01）。中止给药对照组大鼠第2、3和4周AIM评分低于模型组（P<0.01）。中止给药+中药干预组大鼠AIM评分各个时间点均低于同期中止给药对照组（P<0.01）。见图1。

    2.2  各组大鼠双侧尾壳核多巴胺D2受体活性  各组大鼠与正常对照组比较，损毁侧多巴胺D2受体Bmax显著降低（P<0.01），模型组下降幅度较大；模型组和中止给药对照组大鼠多巴胺D2受体KD值升高（P<0.01）。中药干预组大鼠多巴胺D2受体KD值低于模型组（P<0.01），Bmax高于模型组（P<0.01）；中止给药+中药干预组与中止给药对照组比较，多巴胺D2受体KD值明显降低（P<0.01），Bmax升高（P<0.05）。见表1。表1  中药对异动症大鼠双侧尾壳核多巴胺D2受体活性的影响

    3  讨  论

    在PD的发病机制中不仅由于脑中多巴胺神经元的减少，多巴胺能受体也起重要作用。多巴胺能受体分为D1和D2两族［6］，PD的病理主要涉及的是D2的损害。LD是临床上疗效较好的多巴类替代药物，L?dopa在体内转化为多巴胺后，多巴胺可通过自身氧化代谢生成具有细胞毒的的多巴醌和其他自由基。因此，LD可能加速多巴胺神经元的变性，具有一定神经毒性。Nakao等［7］提出纹状体神经元可将外源性多巴转换成多巴胺，增加的多巴胺作用于突触后多巴胺D2受体引起D2受体下调，使纹状体损毁侧与其健侧的D2受体表达数减少。Brooks等［8］运用正发射断层照相术（positron emission tomography，PET）和多巴胺D2受体PET显像剂11C?雷氯必利研究比较了早期和晚期对多巴胺制剂反应波动的PD患者的D2受体，结果发现前者基底节D2受体放射性结合率正常或增高，而后者则明显下降（尾核、壳核部分分别下降30％和18％）。

    结合本实验结果，异动症大鼠随着LD腹腔注射时间的延长，异动症症状愈发加重，纹状体D2受体亲和力明显下降，健侧亲和力也有下降。我们认为LD虽然能明显改善PD的症状，但LD治疗能使纹状体多巴胺D2受体下调，D2受体下调到一定阈值可能为LD长期治疗后引起疗效减退的原因。

    本次实验从异动症行为学检测可以发现，从第0周到第2周，中药干预组和模型组的异动症症状均略有加重。从第2周末到第4周，模型组的异动症症状进一步加重，而中药干预组症状有明显减轻。同时，中药干预组与模型组比较，D2受体亲和力明显增高。从结果中进一步可以看到，异动症大鼠停用左旋多巴后，异动症症状均有下降趋势，但加用中药后，下降趋势更明显。受体活性结果也表明，中止给药+中药干预组与中止给药对照组比较，D2受体亲和力上调更明显。说明中药可明显改善LID大鼠双侧尾壳核多巴胺D2受体活性，撤药可部分恢复多巴胺D2受体活性，加用中药效果更佳。故认为滋补肝肾、通络解毒中药可以有效缓解异动症症状，明显改善D2受体功能。

    我们在临床研究中证实，滋补肝肾、通络解毒中药具有增效减毒作用［9］。过去在滋补肝肾、通络解毒中药治疗PD大鼠的研究中发现，中药可通过清除氧自由基［10］，增加大鼠酪氨酸羟化酶及其信使核糖核酸的表达［11］，抑制多巴胺神经元的凋亡［12］等机制来改善PD大鼠的旋转行为［13］。而这些机制与LID密切相关，故可以认为滋补肝肾、通络解毒中药具有多靶点作用。

【】
  1 Ba MW, Liu ZG, Kong M, et al. Establishment and evaluation of levodopa?induced dyskinesias model in rats with Parkinson's disease. Shanghai Jiao Tong Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2006; 26(7): 810. Chinese.

巴茂文, 刘振国, 孔敏, 等. 左旋多巴诱发帕金森病大鼠异动症模型的建立和评价. 上海大学学报 (医学版 ). 2006; 26(7): 810.

2 Bao XM, Shu SY. Stereotaxic atlas of rat brain. Beijing: People's Medical Publishing House. 1991: 53. Chinese.

包新民, 舒思云. 大鼠脑立体定位图谱. 北京: 人民卫生出版社. 1991: 53.

3 Carman LS, Gage GH, Shults CW. Partial lesion of the substantia nigra: relation between extent of lesion and rotational behavior. Brain Res. 1991; 553(2): 275?283.

4 Cao XB, Sun SG, Xu Y, et al. Study of dyskinesia induced by L?dopa in rat model of Parkinson's disease. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2004; 84(6): 505?507. Chinese.

曹学兵, 孙圣刚, 徐岩, 等. 左旋多巴治疗帕金森病诱发异动症的实验研究. 中华医学杂志. 2004; 84(6): 505?507.

5 Zhang WM, Cai YQ, Xu RX, et al. The activity change of dopamine D2 receptors in caudate?putamen of Parkinson's disease model rats. Zhonghua Shen Jing Wai Ke Ji Bing Yan Jiu Za Zhi. 2002; 1(3): 266?268. Chinese with abstract in English.

张旺明, 蔡颖谦, 徐如祥, 等. 帕金森病大鼠模型尾壳核多巴胺D2受体活性变化研究. 中华神经外科疾病研究杂志. 2002; 1(3): 266?268.

6 Sokoloff P, Schwartz JG. Novel dopamine receptors half a decade later. Trends Pharmacol Sci. 1995; 16(8): 270?275.

7 Nakao N, Shintani?Mizushima A, Kakishita K. The ability of grafted human sympathetic neurons to synthesize and store dopamine: a potential mechanism for the clinical effect of sympathetic neuron autografts in patients with Parkinson's disease. Exp Neurol. 2004; 188(1): 65?73.

8 Brooks DJ, Ibanez V, Sawle GV. Striatal D2 receptor status in patients with Parkinson's disease, striatonigral degeneration, and progressive supranuclear palsy, measured with 11c?raclopride and positron emission tomography. Ann Neurol. 1992; 31(2): 184?192.

9 Yuan CX, Hu JH. Treatment of Parkinson's disease in 30 cases by nourishing liver and kidneys, unblocking collaterals and relieving toxin. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi. 2004; 38(8): 8?9. Chinese with abstract in English.

袁灿兴, 胡建华. 滋补肝肾、通络解毒法治疗帕金森病30例. 上海中医药杂志. 2004; 38(8): 8?9.

10 He JC, Yuan CX, Li YM, et al. Effect of Chinese herbs to nourish liver and kidney, clear meridians and remove toxic substance on oxidation stress response of rat model with Parkinson's disease. Zhongguo Xin Yao Yu Lin Chuang Za Zhi. 2003; 22(3): 160?163. Chinese with abstract in English.

何建成, 袁灿兴, 李亚明, 等. 滋补肝肾通络解毒中药对帕金森病大鼠模型氧化应激反应的影响. 新药与临床杂志. 2003; 22(3): 160?163.

11 He JC, Yuan CX, Wei HC, et al. Effect of integrative Chinese?Western medication on TH and TH mRNA of rats with Parkinson's disease. Zhongguo Lao Nian Xue Za Zhi. 2006; 26(1): 54?56. Chinese with abstract in English.

何建成, 袁灿兴, 卫洪昌, 等. 美多巴和中药合用对帕金森病大鼠酪氨酸羟化酶(TH)及TH mRNA的影响. 中国老年学杂志. 2006; 26(1): 54?56.

12 He JC, Yuan CX, Wei HC, et al. Effect of Chinese herbs to tonify liver and kidney, clear meridians and removing toxic substances on rat cells apoptosis with Parkinson's disease. Zhongguo Lao Nian Xue Za Zhi. 2003; 23(2): 114?116. Chinese with abstract in English.

何建成, 袁灿兴, 卫洪昌, 等. 滋补肝肾通络解毒中药对帕金森病大鼠细胞凋亡的影响. 中国老年学杂志. 2003; 23(2): 114?116.

13 He JC, Yuan CX, Wei HC, et al. Effect of Chinese and Western medicine integration on spinning behavior of rats with Parkinson's disease. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2003; 1(4): 293?295. Chinese with abstract in English.

何建成, 袁灿兴, 卫洪昌, 等. 中西药合用对帕金森病大鼠旋转行为的影响. 中西医结合学报. 2003; 1(4)：293?295