大鼠肾虚型颈椎病模型的建立

【摘要】  采用病、证模型复合的方法建立大鼠肾亏型颈椎病动物模型。 方法：选择3月龄雌性SPF级SD大鼠30只，随机分为正常组、颈椎病模型组和肾虚型颈椎病模型组，每组10只。采用动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型复合去卵巢肾虚亏模型的方法建立肾虚型颈椎病模型。通过检测大鼠子宫及附件形态和质量、血清雌二醇（estradiol，E2）含量验证肾虚证；通过颈椎间盘组织病、Ⅱ型和Ⅹ型胶原的免疫组化检测及聚集蛋白聚糖（aggrecan?1，Agc1）、Ⅱ型前胶原基因（type Ⅱ procollagen gene，Col2a1）、基质金属蛋白酶?13（matrix metalloproteinase?13，MMP?13）和基质金属蛋白酶抑制剂?1（tissue inhibitor of metalloproteinases?1，TIMP?1）的基因表达情况评判椎间盘退变。 结果：与正常组和颈椎病模型组相比，肾虚型颈椎病模型组动物子宫及附件形态萎缩、质量减轻，血清雌二醇含量降低，颈椎间盘组织病理学退变更加明显，Ⅱ型胶原蛋白表达减少，Ⅹ型胶原表达增高，Agc1和Col2a1基因表达降低，MMP?13基因表达增高。 结论：通过病、证模型复合的方式建立了肾虚型颈椎病模型，肾虚可以加重颈椎间盘的退变。

【关键词】  肾虚 颈椎病 病证结合 动物疾病模型 大鼠

    Objective: To establish a rat model of cervical syndrome (CS) with kidney deficiency.

    Methods: A group of 30 three?month?old female Sprague?Dawley rats were randomly divided into normal control group, CS group and CS with kidney deficiency group (combined group), with 10 rats in each group. Rats in the normal control group received no treatment, rats in the CS group underwent only resection of cervical muscles and ligaments as unbalanced dynamic and static animal model, and rats in combined group underwent resection of both cervical muscles and ovaries as kidney deficiency model. Serum and cervical intervertebral discs were collected. Kidney deficiency was determined by observing the morphologic changes of uterus and appendages, detecting the weight of uterus and appendages and the content of serum estradiol (E2). The degeneration of intervertebral discs was determined by detecting the histopathology, the expressions of type Ⅱcollagen and type Ⅹcollagen proteins, and the expressions of aggrecan?1 (Agc1), type Ⅱ procollagen gene (Col2a1), matrix metalloproteinase?13 (MMP?13) and tissue inhibitor of metalloproteinases?1 (TIMP?1) mRNAs.

    Results: Compared with those in the normal control group and CS group, the rats in the combined group were noted with the uterus atrophied, the caliber of oviduct thinned, the weight of uterus and appendages diminished obviously, the content of serum E2 decreased, cervical intervertebral disc degenerated more seriously, type Ⅱ collagen protein expression decreased, type Ⅹ collagen protein expression increased, Agc1 and Col2a1 mRNA expressions in intervertebral disc decreased, and the MMP?13 mRNA expression increased.

    Conclusion: The rat model of CS with kidney deficiency is established. Kidney deficiency can aggravate cervical intervertebral disc degeneration.

    Keywords: kidney deficiency; cervical syndrome; combining disease and syndrome; disease model, animal; rats

    病证结合模型是依据中医临床辨病与辨证相结合的特点复制的动物模型，病证模型具有单纯疾病模型、单纯证候模型所没有的优点，为中西医结合研究开辟了新的途径。本研究依据中医脏腑理论，结合西医学成果，采用疾病模型复合证候模型的方法，将动静力失衡大鼠颈椎间盘退变动物模型与大鼠去卵巢肾虚模型有机地结合起来，建立肾虚型颈椎病的动物模型。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  实验动物  3月龄SPF级SD雌性大鼠30只，体质量（250±20）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号为SCXK（沪）2003?0003。

    1.1.2  主要仪器  全自动石蜡包埋机、组织脱水机和轮转式切片机（德国Leica公司，型号分别为EG1160型、TP1020型和RM2135型），光学显微镜和图像分析系统（日本Olympus公司，BH?20型），紫外/可见光分光光度计（美国Beckman公司，DU 800/VIS型），四通道荧光实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）仪（澳大利亚Cobett公司，Rotor Gene 3000型），基因扩增仪(德国Eppendorf公司，Mastercycler Personal型)，γ放免计数器（院上海原子核研究所日环仪器厂，SN?682型）。

    1.1.3  主要试剂  雌二醇（estradiol, E2）放射免疫分析药盒（北京北方生物技术研究所），Ⅱ型胶原兔抗鼠抗体（美国Cell Signaling Technology公司)，Ⅹ型胶原兔抗鼠抗体（武汉博士德生物工程有限公司），Ⅱ型、Ⅹ型胶原免疫组化试剂盒（晶美生物工程有限公司），聚集蛋白聚糖（aggrecan?1，Agc1）、Ⅱ型前胶原基因（type Ⅱ procollagen gene, Col2a1）、基质金属蛋白酶?13（matrix metalloproteinase?13，MMP?13）和基质金属蛋白酶抑制剂?1（tissue inhibitor of metalloproteinases?1，TIMP?1）引物（大连浩嘉生物技术有限公司），TRIzol试剂（美国MRC公司），逆转录酶（北京天根生化科技有限公司）。

    1.2  分组与造模方法

    1.2.1  分组方法  将30只大鼠按随机区组设计，分为正常组、颈椎病模型组（简称颈椎病组）和肾虚型颈椎病模型组（简称复合模型组），每组10只。

    1.2.2  动物模型建立方法  采用去卵巢肾虚模型［1］，氯胺酮（0.1 g/kg）腹腔注射麻醉，无菌操作下经腰背侧正中入路进入，分开腰部筋膜，分离暴露卵巢，结扎输卵管和周围血管后，摘除卵巢。然后按相同的方法摘除另一侧卵巢。

    颈椎病模型采用动静力失衡大鼠椎间盘退变模型［2］。将大鼠颈后部剪毛和清洁后，氯胺酮(0.1 g/kg)腹腔注射麻醉，取颈背部正中纵向切口，长约2～2.5 cm，切开皮肤后，横向切断颈夹肌和头、颈、寰最长肌，切除颈髂肋肌与头半棘肌，然后依次切除棘上和棘间韧带，建立动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型。

    肾虚型颈椎病模型组在颈椎病模型的基础上复合肾虚亏模型，两模型同时造模，即建立颈椎病模型的同时去除双侧卵巢建立肾虚模型。造模3个月后，动物取材。正常组大鼠未施加任何手术。

    1.3  指标测定

    1.3.1  子宫及附件形态和质量  大鼠用戊巴比妥麻醉后，取出子宫及附件，肉眼观察子宫及附件的形态、体积和大小。用天平称取子宫及附件质量。正常组和颈椎病组为了与复合模型组相统一，在取出子宫及附件后，去除双侧卵巢后再称取子宫和附件质量。每组随机取8个样本，进行统计分析。

    1.3.2  血清E2含量测定  大鼠用戊巴比妥麻醉后，腹主动脉采血2 ml，摇匀放入水浴中20 min，离心（2 000 r/min，10 min），分离出血清置于－20 ℃保存，用放射免疫法测定血清E2的含量，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行（实验由上海中医药大学核医学实验室完成）。每组随机取8个样本。

    1.3.3  颈椎间盘组织病理学观察  取颈椎间盘，4%多聚甲醛固定24 h。清水冲洗后，20%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA）脱钙4周，脱水、透明、包埋，连续6 μm横断面切片，HE染色。在光学显微镜下观察每个椎间盘正中矢状面。按Miyamoto分级评分标准将椎间盘退变程度分为1～5级［3］，分别定为1、2、3、4和5分。

    1.3.4  颈椎间盘Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原蛋白表达  采用免疫组化方法，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。棕黄色为阳性染色，各个标本在200倍光学显微镜下观察。

    1.3.5  颈椎间盘Agc1、Col2a1、MMP?13和TIMP?1 mRNA表达  用TRIzol法抽提mRNA，逆转录后，采用实时荧光定量PCR的方法检测基因表达。引物的合成：在Nucleoide库中检索兔β?actin mRNA（获得号为NM_031144）、Agc1（获得号为NM_022190）、Col2a1（获得号为NM_012929）、MMP?13（获得号为XM_343345）和TIMP?1 mRNA（获得号为NM_053819）的序列全长。由大连浩嘉生物技术有限公司合成。PCR反应体系：去离子水7 μl，正负链引物各1 μl，cDNA产物1 μl，荧光素酶10 μl，总体积20 μl。循环参数：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循环40次。采用6个样本进行统计，每个标本的cDNA同时平行进行6次观察，结果以待测样本灰度值与β?actin灰度值的比值表示。引物见表1。 表1  Agc1、Col2a1、MMP?13和TIMP?1基因引物序列

    1.4  统计学方法  采用SPSS 13.0软件进行统计分析，实验数据用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

    2  结  果

    2.1  子宫及附件形态和质量

    2.1.1  子宫及附件形态  肉眼观察，颈椎病组大鼠子宫和附件形态与正常组相比无明显变化；复合模型组大鼠和正常组相比，子宫体积变小，输卵管管径变细。

    2.1.2  子宫及附件质量  颈椎病组大鼠子宫和附件质量与正常组比较差异无统计学意义。复合模型组大鼠子宫和附件质量低于正常组和颈椎病组（P<0.01）。见表2。

    2.2  血清E2含量  与正常组相比，颈椎病组血清E2含量稍降低，但差异无统计学意义。复合模型组血清E2含量低于正常组（P<0.05），与颈椎病组相比降低，但差异无统计学意义。见表3。 表2  子宫及附件质量表3  血清雌二醇含量

    2.3  颈椎间盘组织病

    2.3.1  颈椎间盘HE染色  正常组大鼠颈椎间盘基本结构显示，外周由规则排列的纤维环和中央大的髓核组成，软骨终板分为生长软骨层和关节软骨层，关节软骨层由一薄层透明软骨组成，与继发性骨化中心相连接的透明软骨钙化，潮标清晰可见，钙化的关节软骨极薄，钙化软骨与骨髓腔直接接触或与一薄层骨板相邻，钙化的软骨下分布有大的血管。颈椎病组颈椎间盘已出现退行性改变，与正常组相比椎间盘纤维环出现裂隙，板层结构紊乱，排列轻度不规则，髓核轻度破坏或皱缩，软骨终板潮标前移，终板内血管数量、管径尚可。复合模型组颈椎间盘整体高度尚可，椎间盘突出，纤维环排列紊乱，髓核较小，细胞数量减少，软骨终板厚度明显变小，潮标前移，终板内血管数量、管径尚可。见图1。

    2.3.2  颈椎间盘退变程度分级  与正常组比较，颈椎病组和复合模型组Miyamoto评分分值均增高（P<0.05，P<0.01）。与颈椎病组相比，复合模型组分值增高（P<0.01）。见表4。 表4  Miyamoto评分

    2.4  颈椎间盘Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原免疫组化染色  正常组Ⅱ型胶原阳性细胞在髓核、纤维环内层和软骨终板均有表达。与正常组相比，颈椎病组Ⅱ型胶原阳性细胞表达减少；复合模型组Ⅱ型胶原的阳性表达与正常组和颈椎病组比较均明显降低，主要表现在纤维环。见图2。

    正常组椎间盘Ⅹ型胶原主要表达在髓核。颈椎病组Ⅹ型胶原表达增高，复合模型组Ⅹ型胶原表达与正常组和颈椎病组相比均有不同程度的增高。见图3。

    2.5  颈椎间盘Agc1、Col2a1、MMP?13和TIMP?1 mRNA表达  颈椎病组、复合模型组Agc1基因表达与正常组相比均降低（P<0.01）；两模型组Col2a1基因表达与正常组相比均降低，且复合模型组与正常组相比差异有统计学意义（P<0.05）；颈椎病组、复合模型组MMP?13基因表达与正常组相比增高（P<0.05，P<0.01），且复合模型组高于颈椎病组（P<0.01）；两模型组TIMP?1基因表达与正常组相比降低，差异无统计学意义。见表5。 表5  Agc1、Col2a1、MMP?13和TIMP?1 mRNA表达

    3  讨  论

    病证结合动物模型的研究一直处于非常重要的地位，从中医的形成和来分析，众多问题单凭临床经验的积累和探索是无法解决的。没有理想的中医动物模型，很多深入研究是难以进行的［4］。

    肾虚与颈椎病之间存在密切的关系。性激素的内环境的变化反映出肾气的衰退，性激素水平可作为肾虚证的指标［5］。肾虚的女性患者卵巢功能均有不同程度的减退，表现为雌激素水平下降［6］。在雌性动物，肾虚的主要特征之一即是卵巢功能低下所致的雌激素水平下降。本研究利用切除卵巢的方法造成肾亏模型。肾的部分生理功能相当于现代医学的下丘脑?垂体?卵巢轴的调节功能，肾虚则功能失调，就会影响下丘脑?垂体?卵巢轴的调节功能，使雌激素分泌减少［7］。复合模型组动物子宫及附件形态、质量和血清E2水平，与正常组相比差异有统计学意义，说明大鼠去卵巢后，中医“肾”的功能明显降低，出现了肾亏。

    动、静力失衡颈椎间盘退变模型符合颈椎病生物力学原理，使动静力系统失去了原有的平衡，导致了颈椎间盘的退变。颈椎病发生发展的基本病理改变是颈椎间盘退变。根据“动力失衡为先，静力失衡为主”的颈椎病病机［8］，破坏大鼠颈部动静力平衡系统，可以加快颈椎间盘退变的进程［2, 9］。椎间盘退变类型根据其组成部分可分为髓核退变、纤维环退变和软骨终板退变［10］。在组织病理学方面，表现为椎间盘结构的异常，如髓核皱缩，软骨终板潮标前移，纤维环破坏等。Peng等［11］的研究提示，在退变严重的椎间盘，基质和细胞表现出纤维化，潮标前移，钙化软骨增厚，软骨终板钙化层的厚度和颈椎退变程度间呈正相关。椎间盘结构的改变直接影响椎间盘功能的变化。椎间盘的主要成分是胶原、蛋白多糖和水。聚集蛋白聚糖是椎间盘蛋白多糖中最主要的一种，主要存在于髓核中。椎间盘退变的主要生物化学变化是蛋白多糖的减少，导致椎间盘黏弹性的丧失，从而使椎间盘功能丧失［12］。陈立等［13］实验研究表明，异常生物力学环境可直接导致终板蛋白多糖含量的不断减少和成分比例的改变。动静力失衡颈椎病模型使维持颈椎力学平衡的动静力系统遭到破坏，势必引起颈椎间盘所受的应力异常，从而促使蛋白多糖含量的不断减少。Ⅱ型胶原是胶原的主要成分，起着承受和吸收传导压力的作用，在椎间盘退变过程中，Ⅱ型胶原表达逐渐减少［11］。Ⅹ型胶原由肥大软骨细胞特异表达。对于Ⅹ型胶原的作用主要有3种观点：一是参与控制软骨的钙化过程；二是可改变Ⅱ型胶原微纤维的特性，使其更易降解；三是改变细胞外基质的性质，有助于血管的入侵、软骨内化骨［14］。复合模型组颈椎间盘Ⅹ型胶原表达明显增高，椎间盘软骨钙化加重，因此软骨终板厚度降低，潮标前移；此外，复合模型组Ⅱ型胶原降解的增强与X型胶原的增高密切相关。椎间盘退变的重要原因是椎间盘细胞的凋亡。Gibson等［15］认为Ⅹ型胶原的表达是引起软骨细胞凋亡的原因，通过对Ⅹ型胶原表达的抑制可以防止凋亡的发生。在椎间盘基质中存在基质代谢的酶系统，最重要的基质降解酶是中性蛋白酶，其中MMPs是降解细胞外基质的关键酶类，MMPs可被TIMPs抑制，二者维持着椎间盘基质代谢的平衡。随着椎间盘内环境发生改变，激活潜伏状态的降解酶，使椎间盘基质分解加速，导致椎间盘退变 ［12］。实验结果中复合模型组与正常组和颈椎组相比，Agc1和Ⅱ型胶原含量均明显减少，MMP?13表达增高，提示肾虚可加重颈椎间盘的退变，使细胞外基质降解增加。

    从实验结果来看，肾虚型颈椎病组出现子宫及附件形态萎缩、质量减轻、E2降低、颈椎间盘结构破坏、细胞外基质减少，降解酶增加等一系列改变，证实该组动物不仅出现了颈椎间盘的退变，还存在卵巢功能低下所致的肾虚，肾虚加重了椎间盘的退变。

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