局灶性脑缺血预处理对大鼠肿瘤坏死因子表达影响的实验研究
作者：舒勤奋 刘小利 金煜 吴炯 姜寿峰 倪娇娜 罗祖明
【摘要】 目的 观察局灶性缺血预处理对大鼠肿瘤坏死因子（TNF－a）的表达影响，探讨TNF－a与缺血耐受的关系及其在内源性保护机制中的作用。方法 利用线栓法建立局灶性脑缺血耐受的动物模型。选用30只SD大鼠，随机将30只大鼠分为实验组：预缺血+缺血（IP+MCAO）；假手术组（SS+MCAO）：假手术代替IP，余同实验组；对照组（SS+SS），每组10只。评价指标包括神经功能缺损评分、光镜下组织病理改变及免疫组织化学染色和图像分析比较各组TNF－a的表达变化。结果 局灶性IP能够明显改善3d后的大鼠的神经功能评分，减轻组织学的损伤，下调了TNF－a的表达，IOD值实验组（8109.53±571.21）对比假手术组（10704.72±584.01），差异有统计学意义（F=233.59,P＜0.05）。结论 局灶性缺血预处理对随后的脑梗死有明显的保护作用，能够诱导缺血耐受的产生，其可能的机制是通过下调肿瘤坏死因子的表达。
【关键词】 缺血预处理 缺血耐受 大脑中动脉栓塞 肿瘤坏死因子
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To explore the effects of focal cerebral ischemic preconditioning on the expression of tumor necrosis factor-alpha and the relationship of tumor necrosis factor-alpha and ischemic tolerance. Methods The animal model of focal cerebral ischemic tolerance was used. 30 SD rats were divided into 3 groups : IPC+MCAO group, SS+MCAO group and SS+SS group. The infarct volume and histological changes with HE staining were evaluated .The expression of tumor necrosis factor-alpha was evaluated by immunohistochemistry. Results Focal cerebral ischemic preconditioning significantly reduced the following infarct volume and the damage of histology.The interagrated optical density in IPC+MCAO group and SS+MCAO group were （8109.53±571.21） and （10704.72±584.01） respectively,which had statistic significance (F=233.59,P＜0.05). Conclusions Focal cerebral ischemic preconditioning can protect brain and induce ischemic tolerance. Down-regulation of the expression of tumor necrosis factor-alpha may play an important role in the induction of endogenous neuroprotection.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ischemic preconditioning; ischemic tolerance; middle cerebral artery occlusion; tumor necrosis factor-alpha
1990年Kitagawa等[1]发现短暂的缺血预处理（ischemic preconditioning，IP) 能引起机体对再次严重的缺血具有耐受作用。称为缺血耐受（ischemic tolerance，IT）。脑缺血耐受实际上是外界刺激激活了机体内在的保护机制，增加了对下一次严重损伤的抵抗能力，是生物在漫长的进化过程中逐渐形成的一种自我的保护机制。但目前缺血耐受的机制尚不清楚。本次研究旨在研究肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNF－a）在IP后的再次脑梗死中表达的变化，探讨其在缺血耐受中的作用。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 材料和分组
健康SD大鼠30只，雄性，清洁级，体重250～300g，购自四川大学华西动物实验中心，在手术前1周领回。所有大鼠试验前均在25℃恒温，充足供应饲料和饮水。大鼠随机分成实验组、假手术组、对照组，每组10只：实验组：预缺血+IP+大脑中动脉完全阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）；假手术组（Sham surgery，SS）+MCAO：假手术代替IP，余同实验组；对照组（SS+SS）：两次均为假手术。实验组给予IP10 min，3d后给予MCAO） 22 h，再灌注2h；假手术组未进行IP，而单纯暴露动脉处的解剖结构10 min，余同实验组。对照组两次均为暴露解剖结构，未进行IP。
1.2 动物模型的制备
采用郝玉曼等[2]局灶性脑缺血耐受在体动物模型。IP的制备方法：SD大鼠用100g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露出左侧颈总动脉和分叉部，分离动脉分叉处的颈内动脉和颈外动脉，于颈外动脉距分叉处约5mm处剪一小口，将预先准备好的直径为0.235mm，长约5cm，前端加热成圆形的鱼线,用肝素浸泡后从剪口处插入，使鱼线经颈总动脉分叉部进入颈内动脉，向头端深入至分叉以上18~20mm，直至有阻力时，即阻断大脑中动脉（middle cerebral artery ,MCA）入口处，结扎颈外动脉近心端，10min后从颈外动脉轻轻抽出拴线至结扎处，形成第一次再灌注，形成预缺血。3d后，麻醉3组大鼠，拆除皮肤缝线，找到颈外动脉的结扎端，重新剪口插线至18～20mm，再次阻断MCA，结扎颈外动脉的近心端，将线尾留在皮外。2h后抽出拴线，形成第2次再灌注。以动物清醒后出现同侧Horner征和对侧前肢不同程度的瘫痪为造模成功标准。各组动物均在术中用加热板使其肛温维持在37℃左右。术后单笼饲养。22h后处死。
1.3 检测指标：
1.3.1 神经功能缺损评分（neurologic deficit score, NDS）
[3]（在动物清醒后由协作者盲法评分进行）0分：无神经功能缺损症状；1分：轻度局灶性神经功能缺损（不能完全伸展右前肢）； 2分：中度神经功能缺损（向右侧转圈）；3分：重度神经功能缺损（向右侧倾倒）； 4分：不能自发行走，意识水平降低。
1.3.2 光镜病理改变及免疫组织化学染色及测定
各组动物均在预定时间处死，迅速断头取脑，浸入40g/L多聚甲醛溶液固定24h，常规石蜡包埋，病理切片。做5μm的连续冠状切片，采用SP法免疫组化染色。采用Nick＆Spot图像采集分析系统进行图像处理，在高倍镜（400倍）下观察不重叠的8个视野阳性细胞的表达，结果用积分光密度（interagrated optical density，IOD）表示阳性TNF－a表达信号的强弱。
1.4 统计学方法
采用SPSS 11.0软件包进行分析。计量数据均采用 均数±标准差（x±s）表示。组间计量资料比较采用单因素方差分析软件处理；等级资料采用秩和检验。设P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组神经功能缺损评分结果比较见表1。
由表1可见，假手术组及实验组均出现不同程度的对侧肢体的瘫痪，两组比较，差异有统计学意义（u＝2.00，P<0.05）。对照组无明显神经功能缺损。
2.2 三组的脑组织的病理变化比较
在光镜下可见各组有不同程度的病理改变（见封二图1、2、3）。
2.3 三组的免疫组化染色示TNF－a的表达比较（见封二图4、5、6）
观察三组梗死灶周围的脑组织内TNF－a的表达在对照组表达很少，着色较浅，分布弥散。在假手术组表达较多，在镜下满视野弥漫分布，实验组表达较假手术组明显减少，在梗死周边区表达减轻。经图像分析测定实验组IOD值（8109.53±571.21）与假手术组IOD值（10704.72±584.01）及对照组（4423.24±436.76）比较，差异有统计学意义（F＝233.59，P<0.05）。
3 讨论
缺血耐受的现象发生存在早期和晚期的两个不同的阶段。在早期的耐受效应（IP后30min~24h）中主要是通过蛋白翻译后的修饰，影响细胞功能的变化发挥作用；晚期的迟发性的耐受现象（一般可持续数天）则认为是激活了机体的某些信号传导途径，通过磷酸化转录因子激活保护性的靶基因，通过翻译，合成新的蛋白质[4，5]。
本次研究从神经功能缺损、组织病理及免疫组织化学三个层面来进行分析讨论迟发性缺血耐受的形成及可能的机制。在神经功能方面，假手术组及对照组所有动物均出现不同程度的对侧肢体的瘫痪，其中评分为3分重度神经功能缺失占60％，另有25％的出现意识水平的下降，表现为不能行走，对刺激的反应迟钝；在实验组给予预缺血10min处理后，缺损评分普遍较低，其中2分中度神经功能缺失占大部分（55％），主要表现为行走时向右侧转圈，提尾时，右侧上肢明显的呈屈曲状，另有25％的SD大鼠神经功能缺损进一步减轻，行走基本维持正常步态，无明显的转圈现象，只在拉尾时，右侧肢体抓握力明显较左侧减退。统计分析证实这些差异有统计学意义（P<0.05），提示预先给予的10min的IP能够明显地减轻大鼠3d后的神经功能缺损评分；在光镜下组织病方面：对照组基本能维持原有的正常组织结构，而假手术组病理改变最为明显，脑实质内可见大量凝固坏死灶，细胞数量明显减少，组织间隙水肿严重，基底节区神经纤维肿胀，崩解明显。实验组改变较假手术组有所减轻，仍可见尚存的大脑皮层的正常神经元排列结构，且组织间隙水肿较假手术组明显减轻，脑实质内坏死灶数量也减少。以上病理学改变也显示IP能够明显地减轻脑损伤，减轻神经元的坏死，组织间隙的水肿。两方面结果说明10min的缺血预处理能够诱导了脑缺血耐受的形成，具有神经保护作用。
对于其可能的机制探索，本次研究进行了炎性因子TNF－a免疫组化的分析，结果表明三组梗死灶周围的脑组织均有不同程度的TNF－a表达，对照组TNF－a很少表达而假手术组表达水平在三组中最高，镜下观察满视野分布，且染色较深。在给予预缺血10min处理后TNF－a表达减少，以上结果提示TNF－a可能与晚期的迟发性的耐受有关。
TNF－a是由巨噬细胞、单核细胞产生的一种多肽类的细胞因子，其基因表达产物先是生成233个氨基酸残基组成的前体，其中含有76个氨基酸残基的信号肽，切除信号肽后才能转化成有活性的TNF。成熟后的TNF为157个氨基酸，分子量为17kDa，在活化的巨噬细胞内以膜结合型存在并以旁分泌或自分泌的形式释放。体内多种细胞存在TNF的受体如淋巴细胞、多核细胞、内皮细胞、成纤维细胞、神经元及胶质细胞等。有研究结果表明，注射TNF－a后，可使梗死体积扩大，加重脑水肿，而应用TNF－MoAb阻断内源性的TNF－a可显著减轻脑损伤。在缺血后的不同时相，缺血区产生各种炎性细胞因子诱导粘附分子的表达，并进一步促进白细胞的浸润，产生炎症反应，加重脑损伤，这是一个级联反应过程。TNF－a是介导这一级联反应炎症反应过程的重要损伤因子[6]。TNF－a作为缺血性脑损伤所诱发的初始调节因子，可促发多重反应通路，并根据其来源、靶细胞的不同，在不同阶段产生不同甚至相反的综合性效应。在脑缺血急性期，TNF－a通过诱发和促进炎症、细胞毒性、凝血等反应及多种凋亡途径加剧损伤；后期则发挥其迟发性免疫抑制、促生长、抗氧化及限制、吸收、重塑等保护作用。已有研究证实在给于预先的10min非致死性的IP后，各种炎症因子和炎症介质如TNF－a, NF-kB等炎症相关产物聚集在缺血灶周围，导致脑缺血的炎症反应，同时也启动了脑的内源性抗炎机制[7，8]。
综上所述，预先给予的10min的缺血预处理能够诱导了脑缺血耐受的形成，具有神经保护作用。其可能的机制是下调3d后的再次脑梗死时炎性介质TNF－a的表达。
【】
１ Kitagawa G, Matsumoto M, et al. Ischemic tolerance pheno-menon found in the brain. Brain Res, 1990, 528(1) : 21-24.
2 郝玉曼, 罗祖明, 周东, 等. 局灶性预缺血诱导脑缺血耐受动物模型[J]. 中风与神经疾病杂志, 2003, 20（2）:129－131.
3 Zea-Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke, 1989; 20(2):84-91
4 Moncayo J, de Freitas GR, Bogousslavsky J, et al. Do transient ischemic attacks have a neuroprotective effect[J]. Neurology, 2002, 54(11):2089-2094
5 Johnston, ClaiborneS. Ischemic Preconditioning From Tran-sient Ischemic Attacks?: Data From the Northern California TIA Study. Stroke 2004, 35(Suppl11): 2680-2682.
6 Karikó, Katalin. Inhibition of toll-like receptor and cytokine signaling-a unifying theme in ischemic tolerance[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2004, 24(11) :1288-1304.
7 Liu J, Ginis I, Spatz M, et al. Hypoxicpreconditioning protects cultured neurons against hypoxic stress via TNF-alpha and ceramid[J]. Am J Physiol Cell Physiol 2000, 278 (1):C144-C153.
8 Irene Ginis, Rama Jaiswal, Dace Klimanis, et al. TNF-a-Induced tolerance to ischemic injury involves difference control of NF-kB ransactivation: The role of NF-Kb asso-ciation with P300 Adaptor. J cereb blood Flow metab. 2002, 22(2):142-152.
